產(chǎn)品描述

TranscriptMax T7 High Yield RNA Synthesis Kit 是基于 T7 RNA 聚合酶的高效 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。該試劑盒中含有 T7 RNA 聚合酶、反應(yīng)緩沖液、核苷酸混合液等經(jīng)過(guò)優(yōu)化的試劑，可以將含有 T7 啟動(dòng)子的 DNA 模板高效轉(zhuǎn)錄成 RNA。本試劑盒可應(yīng)用于制備 guide RNA、RNA 標(biāo)準(zhǔn)品等。

產(chǎn)品組分

a. Positive Control Template 是陽(yáng)性對(duì)照，可作為轉(zhuǎn)錄模板使用，用來(lái)測(cè)試體外轉(zhuǎn)錄體系的反應(yīng)效率。在 37℃孵育30 min 條件下，對(duì)照轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系生成的轉(zhuǎn)錄 RNA 產(chǎn)量≥50 μg，其產(chǎn)量在純化后由 NanoDrop 測(cè)定。

保存條件

-20℃保存，有效期 1 年。

實(shí)驗(yàn)流程

1.T7 RNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖

T7 RNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖如圖 1 所示。

2.DNA 轉(zhuǎn)錄模板類(lèi)型

2.1 質(zhì)粒模板

帶有 T7 啟動(dòng)子的質(zhì)粒可以作為轉(zhuǎn)錄模板，但是質(zhì)粒必須要線性化，可通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶或 PCR 擴(kuò)增的方法將質(zhì)粒線性化。質(zhì)粒線性化后，將純化后的產(chǎn)物作為模板，每個(gè)反應(yīng)體系建議加入 1 μg 的線性化質(zhì)粒作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

2.2 PCR 產(chǎn)物模板

帶有 T7 啟動(dòng)子的 PCR 產(chǎn)物可以作為轉(zhuǎn)錄模板。需要通過(guò)電泳確定 PCR 產(chǎn)物的特異性和濃度，一般在 20 μL 的體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 2-5 μL 的 PCR 產(chǎn)物作為模板。

2.3 合成的DNA模板

帶有 T7 啟動(dòng)子的合成 DNA 片段可以作為轉(zhuǎn)錄模板。一般將合成的 T7 oligo 和 T7 oligo 反向互補(bǔ)的模板鏈退火后作為模板，每個(gè)反應(yīng)體系建議加入 0.25 μM-1 μM 的退火產(chǎn)物作為模板。

3.體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

3.1 按下表試劑的順序進(jìn)行反應(yīng)體系的配制。

· 請(qǐng)將試劑解凍并完全混勻后再使用。
· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亞精胺，而亞精胺與核酸容易形成復(fù)合體沉淀，DNA 轉(zhuǎn)錄模板盡量最后加入到體系中。
· 上述反應(yīng)體系的總體積為 20 μL，可適當(dāng)?shù)缺壤{(diào)整反應(yīng)體系。

3.2 將上述試劑充分混勻，然后短暫離心，在 37℃下孵育 0.5-1 h 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

3.3 37℃孵育結(jié)束后，后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純化推薦使用 Tolo RNAclean Kit (#36201) ，該試劑盒具有徹底去除 DNA 模板殘留，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

注意事項(xiàng)

1. 使用質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)錄模板的時(shí)候，質(zhì)粒必須要進(jìn)行線性化處理，否則轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)度大小不一的情況。

2. 轉(zhuǎn)錄模板的純度會(huì)顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高鹽溶液均可顯著抑制體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，導(dǎo)致 RNA 合成量減少。

3. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)選用無(wú)核酸酶的槍頭和離心管。