南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院孟慶國課題組研究了MIRA 和 MIRA-LFD 螺原體檢測(cè)方法的開發(fā)和應(yīng)用。相關(guān)研究成果以“Development and application of the MIRA and MIRA-LFD detection methods of Spiroplasma eriocheiris”為題在國際學(xué)術(shù)期刊journal of invertebrate pathology在線發(fā)表，期刊影響因子為3.4。

研究背景：

中華絨螯蟹養(yǎng)殖已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的主導(dǎo)和支柱。由螺原體引起的顫抖病（TD）是中華絨螯蟹最具破壞性的疾病。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，對(duì)疾病的預(yù)防、控制和及時(shí)治療具有重要意義。本研究構(gòu)建了一種能在室溫下快速簡(jiǎn)便檢測(cè)螺原體的核酸擴(kuò)增方法-多酶恒溫快速擴(kuò)增法（MIRA）和能以視覺的形式迅速讀出的方式MIRA檢測(cè)結(jié)果的MIRA-LFD。

研究結(jié)果：

本研究根據(jù)螺原體的保守基因序列，構(gòu)建并篩選了合適的擴(kuò)增引物。設(shè)計(jì)并標(biāo)記了相關(guān)的特異性探針和所選的特異性擴(kuò)增引物。然后對(duì) MIRA 和 MIRA-LFD 反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，MIRA 和 MIRA-FFD 分別能在 37℃的溫度下用 30 分鐘和 10 分鐘鑒定出螺原體。

為了研究 MIRA 和 MIRA-LFD 的特異性，選擇了三種革蘭氏陰性菌（枯草桿菌、蘇云金芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌）、三種革蘭氏陽性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌）和螺原體。結(jié)果表明，MIRA 和 MIRA-LFD 對(duì) 螺原體具有高度特異性，對(duì)其他六種病原體沒有反應(yīng)。

然后對(duì)比了 PCR、MIRA 和 MIRA-LFD 三種檢測(cè)方法的靈敏度。結(jié)果表明，PCR 的檢測(cè)限為 1 ng/L，而 MIRA 和 MIRA-LFD 的檢測(cè)限為 10 pg/L

最后使用優(yōu)化過的MIRA和MIRA-LFD 反應(yīng)體系、反應(yīng)引物、反應(yīng)條件，針對(duì)隨機(jī)提取的17個(gè)樣本DNA以及陽性對(duì)照與陰性對(duì)照分別進(jìn)行了中華絨螯蟹螺原體MIRA，MIRA-LFD和PCR檢測(cè). 通過分析比對(duì)不同檢測(cè)方法的結(jié)果，判斷本實(shí)驗(yàn)所建立的中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測(cè)方法可行。

總之，本研究構(gòu)建的MIRA 和 MIRA-LFD 可用于快速檢測(cè)中華絨螯蟹螺原體，具有快速、靈敏和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，不需要任何專業(yè)設(shè)備即可檢測(cè)到螺原體。這些檢測(cè)方法對(duì)于中華絨螯蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖中的顫抖病控制至關(guān)重要。在這種情況下，可以及時(shí)采取早期檢測(cè)措施，避免病原體的傳播，減少中華絨螯蟹顫抖病造成的損失，從而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

文中涉及使用的檢測(cè)試紙條以及MIRA核酸擴(kuò)增試劑盒如下表所示，沃博生物現(xiàn)貨提供：