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下一代分子診斷技術(shù):CRISPR/Cas技術(shù)總結(jié)

近年來,以CRISPR/Cas為代表的基因編輯帶來了生物技術(shù)革命性的進步,分別在20152017年兩次被Science評為年度突破性科學進展之首,獲評Nature10年最具影響力的五大科學事件之首和2020年諾貝爾化學獎。短短幾年時間,CRISPR技術(shù)成為科研界的熱門內(nèi)容,被稱為下一代分子診斷技術(shù)!

CRISPR/Cas系統(tǒng)介紹:

     1987年,CRISPR 位點在細菌基因組中被發(fā)現(xiàn),2002CRISPR相關(guān)蛋白被發(fā)現(xiàn),隨后證實CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA引導的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),可以抵御病毒、質(zhì)粒等入侵遺傳元素,其免疫過程大致可以分為三個階段:適應(yīng)、表達和干擾。

1)適應(yīng)階段Cas蛋白識別并捕獲外來核酸片段,獲取新間隔序列,并整合插入自身CRISPR陣列,形成免疫記憶。

2)表達階段當外來核酸再次入侵時,從CRISPR陣列中相對應(yīng)的間隔序列,轉(zhuǎn)錄出CRISPRRNAcrRNA)前體并加工獲得小的、成熟的crRNA,其中包含一個保守的重復序列和一個間隔序列,crRNA進一步與一個或多個Cas蛋白相互作用,形成RNribonucleoprotein)復合體。

3)干擾階段Cas-crRNA復合體識別外來核酸,通過crRNA靶向目標核酸區(qū)域,介導Cas蛋白特異性地破壞入侵核酸。

CRISPR/Cas可分為二大類群:第1類以多個Cas組成的效應(yīng)復合體行使功能為特征,包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型;第2類則只需單個多結(jié)構(gòu)域的Cas,包括Ⅱ(Cas9)、Ⅴ(Cas12)和Ⅵ(Cas13)型。第2類系統(tǒng)簡單、高效、操作方便,是目前主要的基因編輯系統(tǒng),其中最具代表性的是Cas9

 

                                                                                 Cas9編輯基因原理

     相比Cas9Cas12aCas13a僅需crRNA 即可實現(xiàn)特異性靶位點切割,這表明其系統(tǒng)更為簡潔,具有成為精度更高、安全性更好的新一代基因編輯工具的潛力。

基于Cas12a的分子檢測系統(tǒng):

      廣泛應(yīng)用于核酸檢測的三種Cas12a蛋白包括LbCas12aAsCas12aFnCas12a,其中LbCas12a的反式切割活性最強。2017Jennifer Doudna團隊開發(fā)了DETECTRDNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)檢測技術(shù),利用LbCas12aLachnospiraceae bacterium ND2006)與crRNA復合物,并在crRNA引導下利用RuvC結(jié)構(gòu)域切割PAMTTTN)序列下游18~25nt的靶DNA,在識別并切割靶標dsDNA的同時,激發(fā)Cas12a的反式切割活性,切割反應(yīng)體系中的ssDNA報告分子。ssDNA報告分子標記有熒光基團和猝滅基團,一旦切割,熒光基團和猝滅基團被分離,就會產(chǎn)生穩(wěn)定而強烈的熒光信號,熒光信號的強度可以指示檢 測樣本中靶標的量。此外,DETECTR還與重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)結(jié)合(recombinase polymerase amplification,RPA),不僅提高了檢測分析的靈敏度(amol/L水平),而且避免了對復雜、昂貴設(shè)備的需求。該技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用于人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)和SARS-CoV-2的檢測。

 

                          DETECTR檢測方法原理圖

2018年王金、趙國屏團隊建立了HOLMES(one-hour lowcost multipurpose highly efficient system)檢測技術(shù),聯(lián)合LbCas12a與PCR擴增,可以在1 h內(nèi)完成對偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)和日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的檢測,靈敏度可以達到1~10 amol/L,此外還可以準確區(qū)分病毒基因型以及人類的單核苷酸多態(tài)性 。但是,該技術(shù)聯(lián)合PCR擴增提高穩(wěn)定性的同時也增加了檢測時間和設(shè)備依賴性。

基于Cas12b的分子檢測系統(tǒng):

    來源于嗜熱菌的Cas12b含有單個RuvC結(jié)構(gòu)域,脫靶效應(yīng)低且同樣具有反式切割活性。CRISPRCas12b是雙RNA引導的DNA核酸內(nèi)切酶系統(tǒng),可以識別和切割靶向dsDNA或ssDNA,也可以非特異性切割ssDNA。當靶向dsDNA時,Cas12b依靠PAM序列(TTC或TAC)完成順式切割。當靶向ssDNA時,Cas12b可不依賴PAM序列實現(xiàn)切割,而且切割活性高于dsDNA。

    根據(jù)這些特性,王金、趙國屏團隊建立了升級版的HOLMESv2,將AacCas12b(Alicyclobacillus acidoterrestris)蛋白與環(huán)介導等溫擴增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)結(jié)合,只有含有5?-TTC-3?的dsDNA或切割后具有的5?-TAC-3?的DNA序列才能激活AacCas12b反式切割活性,該技術(shù)實現(xiàn)了DNA、RNA特異性檢測以及區(qū)分SNP和定量DNA甲基化。

   2019年,Dai等開發(fā)了基于CRISPR-Cas12a的E-CRISPR檢測技術(shù),通過CRISPR-Cas系統(tǒng)來影響電信號輸出,利用Cas12a的反式切割活性獲得高傳導信號。該檢測技術(shù)將修飾有3′-亞甲基藍(3′-MB)標簽的ssDNA報告分子固定于金電極上,在靶DNA存在的情況下,Cas12a-crRNA反式切割MB-ssDNA分子,亞甲基藍標簽的分離,會使電化學信號降低。在沒有靶標DNA存在時,Cas12a的反式切割活性保持沉默,ssDNA分子保留在電極表面,從而導致亞甲基藍的高電化學電流。

                                                                     SHERLOCK檢測方法原理

    2020年,Ding等開發(fā)了AIOD CRISPR(all-in-one dual CRISPR-Cas12a)檢測技術(shù),將RPA擴增和CRISPR檢測的所有反應(yīng)組分混合,在引入兩個crRNA的同時,添加高濃度ssDNA報告分子,一步即可完成對SARS-CoV-2和HIV-1的檢測。

基于Cas13的分子檢測系統(tǒng):

    Cas13是RNA引導和RNA靶向的核酸酶,具有兩個HEPN結(jié)構(gòu)域,特異性作用于RNA靶標。2017年,張峰團隊開發(fā)了SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)與DETECTR原理相同,但依賴于LwaCas13a(Leptotirichia wadei)核酸酶的活性,識別和切割靶標RNA的同時,反式切割ssDNA報告分子產(chǎn)生熒光信號。


                                                                             SHERLOCK檢測方法原理

   為了解決定量的問題,該團隊開發(fā)了SHERLOCKv2,將4種類型的Cas蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a)組合使用,切割用不同的熒光基團標記的報告分子,在FAM、Cy5、HEX和TEX通道中進行檢測,實現(xiàn)了定量同時檢測4種核酸序列。SHERLOCKv2也被應(yīng)用于側(cè)向流動分析,通過金納米顆粒標記的抗FAM抗體,在試紙條上檢測被切割的報告分子,產(chǎn)生視覺比色信號。

                                            SHERLOCKv2 檢測結(jié)果讀取方式

    2020年,ACKERMAN等聯(lián)合CRISPR診斷和微流控技術(shù)開發(fā)了CARMEN(combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids)檢測平臺,該技術(shù)可以同時檢測8個樣本,169種人類相關(guān)病毒。但由于芯片定制成本高和檢驗操作流程復制,很難應(yīng)用于臨床。該團隊在CARMENv.1的基礎(chǔ)上開發(fā)了mCARMEN(microfluidic combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids),將CRISPR診斷、微陣列技術(shù)與簡化的臨床工作流程相結(jié)合,開發(fā)的mCARMEN呼吸道病毒檢測面板,可同時檢測21種呼吸道病毒,包括SARS-CoV-2及其他冠狀病毒、流感病毒等。

                                 CARMEN-Cas13檢測方法原理

    Arizti-Sanz團隊將擴增與CRISPR-Cas13系統(tǒng)檢測整合為一步診斷平臺SHIN(streamlined highlight of infection to navigate pandemic),通過添加RNase H提高核酸檢測靈敏度,并采用管內(nèi)熒光和配套的智能手機應(yīng)用程序,實現(xiàn)了SARS-CoV-2有效的核酸檢測。SHINE診斷平臺最大限度地減少了對設(shè)備的要求,也減少了結(jié)果讀數(shù)偏差。

基于Cas14的分子檢測系統(tǒng):

    除了Cas12和Cas13系統(tǒng)外,結(jié)構(gòu)緊湊的Cas14蛋白也具有類似的反式切割活性。Cas14是一種靶向ssDNA的CRISPR內(nèi)切酶,與CRISPRCas12相比,Cas14識別和切割目標核酸序列不受PAM序列的限制,而且對crRNA與靶標模板之間的核苷酸錯配的容忍性更低,內(nèi)部序列對核苷酸錯配更敏感,這一特性使Cas14能夠?qū)崿F(xiàn)高保真的區(qū)分SNP?;诖颂匦越⒌腃as14a-DETECTR檢測平臺,已應(yīng)用于人類HERC2基因SNP分型。

                                                                   CRISPR/Cas14a分子檢測示意圖

CRISPR/Cas技術(shù)優(yōu)勢:

發(fā)展至目前,基于CRISPR的核酸檢測技術(shù)具有以下優(yōu)點:

(1)高特異性,可實現(xiàn)單核苷酸點突變檢測;

(2)高靈敏性,可實現(xiàn)單拷貝核酸檢測;

(3)快速性,整個檢測在0.5–1.0h內(nèi)完成;

(4)簡便性,不需專業(yè)設(shè)備及人員,可現(xiàn)場完成;

(5)試劑耐受冷凍干燥,便于儲存和攜帶;

(6)易開發(fā)性,可快速開發(fā)出新核酸檢測試劑盒等。

      隨著進一步的改進和優(yōu)化,其更具通用性,CRISPR核酸檢測技術(shù)將成為POCT的最優(yōu)選。

已報道的多種基于 CRISPR 的分子檢測技術(shù)比較

CRISPR/Cas未來方向

    第一,是新的Cas蛋白的開發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白,不同于Cas12和Cas13,其擅長識別單鏈DNA,豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測通量及降低“脫靶效應(yīng)”提供了方法。

    第二,是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺結(jié)合起來,開發(fā)新穎實用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場效應(yīng)晶體管,以及將Cas系統(tǒng)的報告探針固定于電極上,從而實現(xiàn)不需要使用信號擴增的電化學生物傳感器的構(gòu)建。使用水凝膠作為其響應(yīng)原件實現(xiàn)多樣化的信號輸出。與微流體技術(shù)結(jié)合開發(fā)出的CARMAN技術(shù),可以對數(shù)十個樣本,上百種病毒進行快速檢測,為解決通量低的問題提供了方法等。

RPA試劑盒及試紙條系列:

貨號

產(chǎn)品

規(guī)格

JY0209

雙靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0201

單靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0307

Tiosbio? CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條

50T

JY0301

CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條

50T

JY0308

Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測試紙條(變色龍)

50T

WLB8201KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎(chǔ)型)

48T

WLE8202KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

48T

WLN8203KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLRB8204KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎(chǔ)型)

48T

WLRE8205KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

48T

WLRN8206KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLB5001

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體基礎(chǔ)型)

100T

WLN5002

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLR5003

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體熒光型)

100T

WLRB5001

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體基礎(chǔ)型)

100T

WLRN5002

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLRE5003

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體熒光型)

100T

 

Cas酶系列

貨號

包裝規(guī)格

中文名稱

32108-01

100 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32108-03

1,000 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32117-01

100 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32117-03

1,000 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32118-01

100 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32118-03

1,000 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32119-01

100 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32119-03

1,000 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32104-01

100 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32104-03

1,000 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32116-01

100 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32116-03

1,000 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32106-01

100 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32106-03

1,000 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32110-01

100 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32110-03

1,000 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32101-01

100 pmoL

SpCas9

32101-03

1,000 pmoL

SpCas9

32102-01

100 pmoL

Sp-dCas9

32102-03

1,000 pmoL

Sp-dCas9

32120-01

100 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

32120-03

1,000 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

 

 

 

 



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