阿爾瑪藍(lán)（Alamar Blue）是一種細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，對(duì)各種人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌和真菌提供一種快速和敏感的細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)方法。

阿爾瑪藍(lán)（Alamar Blue）是一種基于刃天青（resazurin）的檢測(cè)試劑。刃天青作為一種一種氧化還原（REDOX）指示劑，根據(jù)細(xì)胞代謝還原情況發(fā)生顏色變化。氧化態(tài)的刃天青呈紫藍(lán)色且基本無(wú)熒光，其還原態(tài)產(chǎn)物試鹵靈（resorufin）轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色且高度熒光，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與呼吸活細(xì)胞數(shù)量呈正比。通過(guò)檢測(cè)呼吸過(guò)程中氧化水平，阿爾瑪藍(lán)用作一種定量檢測(cè)細(xì)胞活力和毒性的直接指示劑。阿爾瑪藍(lán)的顏色變化可通過(guò)普通分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度變化，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為600nm；阿爾瑪藍(lán)的熒光變化可通過(guò)熒光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)在530~560nm之間，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。

檢測(cè)原理：（細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) Cell proliferation assay））

1.生長(zhǎng)中細(xì)胞引起Alamar Blue的化學(xué)還原反應(yīng)；

2. 持續(xù)性細(xì)胞生長(zhǎng)維持還原環(huán)境，使得Alamar Blue呈紅色，發(fā)強(qiáng)熒光；

3. 生長(zhǎng)受抑制維持氧化環(huán)境，使得Alamar Blue呈藍(lán)色，無(wú)熒光；

4. 使用基于熒光或吸光值檢測(cè)的儀器收集數(shù)據(jù)；

5. 熒光檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為530~560nm之間，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm；

6. 吸光值檢測(cè)的波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為600nm；

保存方法：

室溫12個(gè)月穩(wěn)定，2-8°C保存20個(gè)月穩(wěn)定；避光保存；

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：

簡(jiǎn)單：水溶性，只需添加和測(cè)量即可；

靈活：顯色和熒光檢測(cè)，懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞；

無(wú)毒：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，對(duì)使用者和環(huán)境也無(wú)毒；

可靠：大量引用用于細(xì)胞毒性和活力檢測(cè)；

規(guī)模化：簡(jiǎn)單放大體系用于高通量分析

高靈敏：最低可檢測(cè)到50個(gè)細(xì)胞

穩(wěn)定高：獨(dú)特緩沖配方使其能用于長(zhǎng)期研究；

經(jīng)濟(jì)：不需要細(xì)胞裂解，使細(xì)胞能繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)分析；操作時(shí)請(qǐng)注意避光。

注意事項(xiàng)

1. 還原態(tài)的Alamar Blue在水或水溶性緩沖液如PBS中很不穩(wěn)定，但在培養(yǎng)基內(nèi)非常穩(wěn)定。為了確定特定實(shí)驗(yàn)還原態(tài)Alamar Blue的吸光度/熒光值，需準(zhǔn)備100%還原態(tài)Alamar Blue試劑：將Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基按照1:10的比例混合，高壓滅菌15min即可。

2. 適宜的細(xì)胞密度能夠增加檢測(cè)靈敏度。對(duì)于96孔板，建議每孔接種100μl細(xì)胞，細(xì)胞濃度范圍：貼壁細(xì)胞為100-10,000個(gè)/孔，懸浮細(xì)胞在2,000-50,000個(gè)/孔，以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。對(duì)于384孔板，細(xì)胞濃度和接種量均減半。

3. 影響細(xì)胞對(duì)Alamar Blue反應(yīng)的兩大變量為孵育時(shí)間和鋪板密度，建議實(shí)驗(yàn)前需先摸索優(yōu)化這兩個(gè)因素。細(xì)胞密度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性還原反應(yīng)，紅色產(chǎn)物停止增加并開(kāi)始衰減，導(dǎo)致吸光度/熒光水平明顯下跌并伴隨紅色消失。

4. 微生物污染會(huì)還原Alamar Blue。因此對(duì)被污染細(xì)胞使用Alamar Blue檢測(cè)會(huì)引起錯(cuò)誤結(jié)果。

5. Alamar Blue可以用分光光度計(jì)或熒光計(jì)檢測(cè)，但熒光靈敏度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，推薦熒光檢測(cè)。

6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（測(cè)定最佳孵育時(shí)間和細(xì)胞數(shù)量）

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞），對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每個(gè)濃度建議3-6個(gè)復(fù)孔。注：設(shè)置陰性對(duì)照：細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入細(xì)胞；陽(yáng)性對(duì)照：100微升100%還原型Alamar Blue（不含細(xì)胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽(yáng)性對(duì)照孔中加入10微升無(wú)菌的超純水。

3. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（37℃,5% CO2）一定時(shí)間。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開(kāi)始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。

4. 推薦用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm。

5. 普通分光光度計(jì)在570 nm測(cè)定吸光度，參考波長(zhǎng)600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以細(xì)胞數(shù)量或孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)（X軸），Alamar Blue還原率為縱坐標(biāo)（Y軸）。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以測(cè)定出適合的細(xì)胞數(shù)量或孵育時(shí)間（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致）。

二、細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖檢測(cè)

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞），對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。建議細(xì)胞數(shù)量為104/mL，具體每孔需要的細(xì)胞數(shù)量，需根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型決定。

2. 細(xì)胞中加入待檢測(cè)藥物，為檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的作用，請(qǐng)?jiān)O(shè)置合適的對(duì)照組，包括刺激細(xì)胞和非刺激細(xì)胞。

3. 混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO2）一段時(shí)間。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽(yáng)性對(duì)照孔中加入10微升無(wú)菌的超純水。

5. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO2）4-8 h，最佳孵育時(shí)間取決于細(xì)胞類(lèi)型。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開(kāi)始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。

6. 推薦用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm。

7. 普通分光光度計(jì)在570nm測(cè)定吸光度，參考波長(zhǎng)600 nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

活力計(jì)算                               

1.普通分光光度計(jì)檢測(cè)

Alamar Blue還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E570=氧化型Alamar Blue在570 nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=80586；

E600=氧化型Alamar Blue在600 nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=117216；

A570=檢測(cè)孔在570 nm波長(zhǎng)的吸亮度；

A600=檢測(cè)孔在600 nm波長(zhǎng)的吸亮度；

E570′=還原型Alamar Blue在570 nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=155677；

E600′=還原型Alamar Blue在600 nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=14652；

C570=陰性對(duì)照孔在570 nm波長(zhǎng)的吸亮度（培養(yǎng)基，Alamar Blue，無(wú)細(xì)胞）；

C600=陰性對(duì)照孔在600 nm波長(zhǎng)的吸亮度（培養(yǎng)基，Alamar Blue，無(wú)細(xì)胞）；

如果使用570/630 nm和540/600 nm作為替代，則：

E540=氧化型Alamar Blue在540 nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=47619；

E630=氧化型Alamar Blue在630 nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=34798；

E540′=還原型Alamar Blue在540 nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=104395；

E630′=還原型Alamar Blue在630 nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=5494；

2.熒光分光光度計(jì)檢測(cè)

Alamar Blue還原率（％）= （實(shí)驗(yàn)組F590-陰性對(duì)照組F590）/（100%還原型陽(yáng)性對(duì)照F590-陰性對(duì)照組F590）×100

F590=590 nm波長(zhǎng)熒光值

相關(guān)產(chǎn)品：