膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病情兇險(xiǎn)，病死率高，其病原微生物包括細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲(chóng)等，對(duì)醫(yī)療保健構(gòu)成重大威脅。在確定細(xì)菌感染后進(jìn)行快速干預(yù)是預(yù)防敗血癥的關(guān)鍵，但僅有約45%的膿毒性休克患者可獲得陽(yáng)性血培養(yǎng)結(jié)果，這大大制約了膿毒血癥的確診。為了克服傳統(tǒng)方法的局限性，快速診斷是十分重要的。與傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)物的平板計(jì)數(shù)方法相比，之前的研究通常使用表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)（SERS），表面等離子體共振（SPR）或電化學(xué)方法等，盡管這些方法可以在醫(yī)院中提供更直接的細(xì)菌感染篩查，但通常制造復(fù)雜且成本高昂，或者需要大量的預(yù)處理步驟，其靈敏度和特異性也存在一定局限性，以至于無(wú)法被更廣泛地應(yīng)用。因此，急需開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)敗血癥誘導(dǎo)細(xì)菌的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、可重復(fù)使用、靈敏可靠的POC生物傳感器。

在該策略中，研究人員開(kāi)發(fā)了一種GO-CRISPR傳感器，利用重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)和靶激活的Cas12a反式切割技術(shù)，將短的單鏈DNA探針（結(jié)合到單層氧化石墨烯上熒光猝滅）從GO中分離出來(lái)，以恢復(fù)熒光信號(hào)用于檢測(cè)。RPA用于細(xì)菌DNA的等溫?cái)U(kuò)增，避免了基因擴(kuò)增對(duì)復(fù)雜儀器的依賴(lài)。在人體的血清復(fù)雜環(huán)境中，GO-CRISPR系統(tǒng)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌（S.Typhimurium）的檢測(cè)限低至3×103 CFU/mL，對(duì)其他競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌（金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，霍亂弧菌等）干擾實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出良好的特異性。此外，該傳感器提供了顯著的肉眼熒光，從樣本采集到信號(hào)讀出的總時(shí)間不到1.5小時(shí)。綜上所述，所構(gòu)建的GO-CRISPR系統(tǒng)為膿毒癥誘導(dǎo)細(xì)菌的檢測(cè)提供了優(yōu)越的時(shí)效性，并有可能在資源有限的環(huán)境中加強(qiáng)細(xì)菌感染的早期檢測(cè)，加快檢出膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)患者的速度。

文章以“On-Site Fluorescent Detection of Sepsis-Inducing Bacteria using a Graphene-Oxide CRISPR-Cas12a (GO-CRISPR) System”發(fā)表在Analytical chemistry上。本文的通訊作者是來(lái)自美國(guó)弗吉尼亞理工大學(xué)的Juhong Chen。

圖1。使用GO-CRISPR系統(tǒng)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的示意圖。采用等溫重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)擴(kuò)增沙門(mén)氏菌invA基因。擴(kuò)增的沙門(mén)氏菌靶DNA隨后與專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的CRISPR系統(tǒng)和ssDNA-FAM探針?lè)磻?yīng)。在目標(biāo)DNA存在的情況下，CRISPR系統(tǒng)被激活，啟動(dòng)探針的穩(wěn)健降解。降解的探針不能與氧化石墨烯表面結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)，用于沙門(mén)氏菌的視覺(jué)檢測(cè)。

圖2。GO-CRISPR系統(tǒng)的表征。(a)距離依賴(lài)性氧化石墨烯熒光猝滅示意圖。熒光探針上的ssDNA通過(guò)π?π堆疊相互作用附著在氧化石墨烯表面。熒光在靠近氧化石墨烯的地方熄滅。(b) 510 ~ 600 nm范圍內(nèi)不同濃度氧化石墨烯的熒光光譜。(c)不同濃度氧化石墨烯在520 nm處的熒光強(qiáng)度。(d)熒光圖像和強(qiáng)度，用于GO-CRISPR系統(tǒng)可行性分析。

圖3。GO-CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)化。(a,b)不同濃度Cas12a在520 nm處的熒光光譜和強(qiáng)度。(c,d)不同濃度crRNA在520 nm處的熒光光譜和強(qiáng)度。(e,f) GO-CRISPR系統(tǒng)在37℃和室溫下520 nm處的熒光強(qiáng)度和30 min時(shí)的圖像。

圖4。沙門(mén)氏菌DNA檢測(cè)。(a)不同濃度DNA的熒光光譜。(b)不同濃度DNA在520 nm處的熒光強(qiáng)度值與背景的比值，動(dòng)態(tài)范圍線(xiàn)性回歸。(c)用于檢測(cè)不同濃度沙門(mén)氏菌DNA的GO-CRISPR系統(tǒng)的熒光圖像。

圖5。GO-CRISPR系統(tǒng)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的靈敏度和特異性。(a)用于沙門(mén)氏菌特異性檢測(cè)的RPA擴(kuò)增和GO-CRISPR系統(tǒng)示意圖。(b)不同濃度鼠傷寒沙門(mén)氏菌RPA產(chǎn)物的凝膠圖像和熒光強(qiáng)度(NC =陰性對(duì)照)。(c)血清型沙門(mén)氏菌RPA產(chǎn)物的凝膠圖像和熒光強(qiáng)度。(d)有和沒(méi)有鼠傷寒沙門(mén)氏菌的競(jìng)爭(zhēng)菌株(枯草芽孢桿菌、大腸桿菌O157:H7、單核增生乳桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌和所有五種培養(yǎng)物的“混合物”)的RPA產(chǎn)物和熒光強(qiáng)度的凝膠圖像。

圖6。人血清中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。(a)檢測(cè)人血清中沙門(mén)氏菌的GO-CRISPR整個(gè)過(guò)程示意圖。(b)人血清中不同濃度鼠傷寒沙門(mén)氏菌的熒光光譜。(c) RPA產(chǎn)物的凝膠圖像和不同濃度鼠傷寒沙門(mén)氏菌在人血清中的熒光強(qiáng)度。(d)人血清中不同濃度鼠傷寒沙門(mén)氏菌的熒

相關(guān)產(chǎn)品;

RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列