由細菌、病毒、真菌甚至寄生蟲引起的呼吸道感染（RTIs）嚴重威脅全球公共衛(wèi)生，是傳染病和高死亡率的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有400萬人死于呼吸道感染（占全部死亡人數(shù)的7%），其中兒童占12%~19%。細菌引起的呼吸道感染是重癥和死亡病例的主要原因。然而，由細菌引起的RTIs的臨床癥狀與病毒引起的呼吸系統(tǒng)疾病相似，在病原未明確的情況下難以進行針對性的藥物治療。此外，在呼吸道感染高發(fā)時期，由于其強傳播性和季節(jié)性特征，醫(yī)療機構(gòu)將面臨較大的病原檢測負擔(dān)。因此，迫切需要開發(fā)快速、準(zhǔn)確、易于操作的RTIs病原體高通量診斷篩查方法，這對確保適當(dāng)?shù)乃幬镏委熀透腥究刂拼胧┑挠行嵤┚哂兄匾饬x。
目前，基于核酸識別的分子診斷方法在周轉(zhuǎn)周期、特異性、敏感性以及對難以培養(yǎng)病原體的鑒定方面具有明顯優(yōu)勢，是廣泛應(yīng)用于臨床樣本中呼吸道感染（RTIs）診斷的理想選擇。其中由CRISPR介導(dǎo)的診斷技術(shù)是一種前景廣闊的靶向基因檢測技術(shù)，極大提升了檢測的靈敏度、特異性和穩(wěn)健性。然而，大多數(shù)CRISPR介導(dǎo)的診斷仍然依賴于初始擴增階段，這導(dǎo)致可能會出現(xiàn)復(fù)雜反應(yīng)步驟和假陽性信號，導(dǎo)致額外的時間和試劑損耗。為了在病原體診斷中獲得更廣泛和更實際的應(yīng)用，這些CRISPR介導(dǎo)的診斷系統(tǒng)仍需要進一步開發(fā)或改進。
微流控芯片系統(tǒng)由一組通過微流控網(wǎng)絡(luò)連接的功能單元組成，為臨床分子診斷提供了一種小型化的選擇。然而，在以往的工作中可以發(fā)現(xiàn)，獲取目標(biāo)病原體的DNA仍需要長時間的樣本預(yù)處理和芯片外部操作，這增加了操作步驟的復(fù)雜性和結(jié)果的偏差。將DNA提取模塊集成在微流控芯片上，不僅有助于創(chuàng)建可輸入攜帶樣本的平臺，還提供了細菌與DNA之間的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換過程，因此如何滿足分子微生物診斷中靈敏的多重分析需求，還需要進一步研究。
近期，來自福建醫(yī)科大學(xué)、暨南大學(xué)等機構(gòu)的研究人員共同開發(fā)出一種與RAA-CRISPR系統(tǒng)集成化的離心式微流控芯片，并基于此構(gòu)建了多路微流控芯片（AMIC）系統(tǒng)以實現(xiàn)對呼吸道病原體的快速檢測。相關(guān)成果以“Automatic Microfluidic Harmonized RAA-CRISPR Diagnostic System for Rapid and Accurate Identification of Bacterial Respiratory Tract Infections”為題發(fā)表在國際化學(xué)權(quán)威雜志Analytical Chemistry上。
在這項研究中，研究人員報道了一種協(xié)調(diào)的RAA-CRISPR檢測的設(shè)計原理。協(xié)調(diào)的RAA-CRISPR檢測的工作機制分為3個動態(tài)模塊：基于RAA的目標(biāo)基因組DNA的識別和擴增、擴增DNA序列的轉(zhuǎn)錄和Cas13a酶的啟動。其中RAA的工作溫度與CRISPR相同（37~42℃），為一鍋法提供了基礎(chǔ)依據(jù)。
研究證實，基因組DNA的同源序列被引物與重組酶結(jié)合形成的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體識別并實現(xiàn)指數(shù)擴增。T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程需要上游引物與啟動子序列的識別，可有效避免轉(zhuǎn)錄過程中基因組DNA的降解。通過調(diào)控擴增和轉(zhuǎn)錄效率，可穩(wěn)定增加目標(biāo)DNA和相應(yīng)RNA的數(shù)量，為后續(xù)CRISPR反應(yīng)提供啟動子。與通常用于DNA檢測使用的Cas12a酶不同，Cas13a酶是特異性靶向RNA序列的2類vi型效應(yīng)蛋白，并且對靶RNA和非特異性ssRNA具有切割活性。這一特性確保了CRISPR不會影響基于DNA序列的RAA反應(yīng)進程。此外，活化的Cas13a酶在切割被設(shè)計為熒光探針的ssRNA可觸發(fā)熒光的釋放。因此與兩步CRISPR技術(shù)相比，統(tǒng)一的RAA-CRISPR技術(shù)實現(xiàn)了一鍋法檢測，不僅便于反應(yīng)整合，而且提高其反應(yīng)效率。因此，本文提出的基于RAA-CRISPR協(xié)調(diào)策略的AMIC系統(tǒng)提供了一種簡單、高靈敏度、高特異性的熒光DNA檢測方法。
AMIC系統(tǒng)的工作流程和協(xié)調(diào)化RAA-CRISPR檢測的設(shè)計示意圖
本研究在常規(guī)檢測條件下，設(shè)置RAA和cas13a酶的不同濃度組成以此實現(xiàn)窗口對接。結(jié)果表明，設(shè)置RAA濃度在0.6~1.2x之間可以達到良好的早期擴增目的，并為后續(xù)的CRISPR系統(tǒng)反應(yīng)提供足夠數(shù)量的啟動子，考慮到級聯(lián)效應(yīng)和活性保留問題，研究得出0.9x RAA和120 nM Cas13a酶的濃度適合構(gòu)建協(xié)調(diào)化RAA-CRISPR檢測的結(jié)論。同時，在不限制擴增過程的情況下，轉(zhuǎn)錄效率的增加有利于Cas13a酶的激活。為了探索擴增和轉(zhuǎn)錄之間的臨界值，實驗使用了四種不同濃度的DNA來檢測轉(zhuǎn)錄對擴增率的影響。當(dāng)轉(zhuǎn)錄酶活性在4~5U之間時，RAA的反應(yīng)速率處于峰值階段。因此，4U被選擇為最合適的轉(zhuǎn)錄活性，并可為后續(xù)的CRISPR系統(tǒng)提供靶向RNA。此外，系統(tǒng)中過量靶標(biāo)的存在會與crRNA競爭Cas13a酶的結(jié)合位點，從而降低檢測信號，導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。實驗比較了不同市售緩沖液對合成 DNA或RNA模板的RAA和CRISPR介導(dǎo)的檢測的影響，研究表明CutSmart緩沖液顯示出重組酶與Cas13a酶之間更好的協(xié)調(diào)性。
實驗以鮑曼不動桿菌為例設(shè)計并篩選了兩種具有高活性的crRNA，并將其定向到同一靶向RNA的不同區(qū)域，并對單個crRNA和組合crRNA的催化性能進行了測試。結(jié)果表明，組合crRNA在固定靶DNA濃度（1 ng）下檢測時，與單個crRNA反應(yīng)的靈敏度值相比可顯著增加至1.6倍。這一結(jié)果表明組合crRNA在RAA-CRISPR系統(tǒng)中具有反應(yīng)優(yōu)勢，同時這一策略被繼續(xù)用于構(gòu)建其他11種呼吸細菌的實驗。在CRISPR介導(dǎo)的檢測中，Cas13a酶和crRNA 的化學(xué)計量學(xué)是一個關(guān)鍵因素。結(jié)果顯示在體反應(yīng)中，含有7尿嘧啶（U）的FQ報告劑的反應(yīng)速度明顯快于其他不同堿基組成的FQ報告劑（poly-A、poly-U、poly-C和poly-G）或不同長度（5~15個核苷酸）的反應(yīng)，在進一步監(jiān)測FQ報告量對檢測信號的影響時發(fā)現(xiàn)，在500 nM檢測范圍內(nèi)，熒光強度與報告蛋白數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，統(tǒng)一的RAA-CRISPR的建立相比以往的RAA-CRISPR反應(yīng)系統(tǒng)，可以更快速有效地啟動CRISPR/Cas系統(tǒng)的切割活性并進一步節(jié)省了檢測時間，相關(guān)結(jié)果特性可體現(xiàn)在12種呼吸道細菌的檢測時間中。
協(xié)調(diào)RAA-CRISPR檢測方法的構(gòu)建與優(yōu)化示意圖
為了減少底物對隨后的協(xié)調(diào)RAA-CRISPR檢測的影響，實驗將Chelex-100集成到芯片中進行核酸純化。Chelex-100具有顯著的金屬離子特異性選擇性和強大的結(jié)合強度，可促進核酸抑制劑在不同樣品基質(zhì)上的有效吸附。將Chelex-100集成到離心微流控芯片上，提供了一種快速直接的核酸純化方法，從而避免了有機溶劑的使用并簡化了與核酸擴增相關(guān)程序的復(fù)雜性。同時為保證熱裂解過程不影響芯片結(jié)構(gòu)或氣密性，對目標(biāo)呼吸道病原體在95°C下裂解8 min的芯片性能進行了研究，確定此條件為最佳反應(yīng)時間和溫度。對于簡單的熱裂解，細胞裂解過程中釋放的蛋白質(zhì)和鹽沒有被去除，這抑制了下游協(xié)調(diào)化RAA-CRISPR檢測的效率。相比之下，Chelex-100微球的純化有效地去除了反應(yīng)中的蛋白和鹽，增強了后續(xù)CRISPR介導(dǎo)系統(tǒng)的信號。在多個目標(biāo)濃度下，檢測靈敏度和反應(yīng)動力學(xué)均顯著提高。
實驗采用磁珠法、吸附柱法、芯片外Chelex-100和芯片內(nèi)Chelex-100提取DNA，以此來比較相同細菌濃度下四種不同方法的核酸提取效率。選取革蘭氏陽性菌（縮寫為GPB，以肺炎克雷伯菌為代表）和革蘭氏陰性菌（縮寫為GNB，以金黃色葡萄球菌為代表）進行檢測。結(jié)果表明，基于芯片內(nèi)Chelex-100的AMIC系統(tǒng)具有與磁珠法相當(dāng)?shù)膬?yōu)異DNA提取效率，尤其在GPB的提取效率上具有顯著優(yōu)勢。同時AMIC系統(tǒng)在GPB和GNB之間表現(xiàn)出較好的兼容性，芯片集成化操作并未降低Chelex-100的純化效果。此外，芯片集成有效地提高了DNA的利用率（25 μL），這是由于所有提取的DNA都用于AMIC系統(tǒng)中隨后的協(xié)調(diào)RAA-CRISPR檢測，然而芯片外方法僅可利用25 μL中的1 μL。因此AMIC系統(tǒng)的程序集成化大大縮短了診斷的操作周期至40 min即可完成。結(jié)果表明，該核酸提取模塊與AMIC系統(tǒng)中的協(xié)調(diào)RAA-CRISPR反應(yīng)兼容。
集成芯片上的核酸提取
芯片內(nèi)部凍干檢測試劑的存儲特性對于實現(xiàn)AMIC系統(tǒng)的無限制部署至關(guān)重要。通過對不同試劑組分的凍干順序、保護劑的用量、RNase抑制劑的濃度和凍干程序進行優(yōu)化，獲得了理想的即用型AMIC體系。用原始的AMIC緩沖液凍干會導(dǎo)致凍干后活性顯著下降。通過逐步驗證，crRNA和MgAc試劑的使用被確認為關(guān)鍵參數(shù)，因此本實驗多步凍干步驟和添加保護劑的策略有效地保持了AMIC系統(tǒng)的檢測性能。此外，MgAc被儲存在微通道中，在程序執(zhí)行期間DNA溶液將跟隨微通道進入反應(yīng)室，盡管在較低的目標(biāo)DNA濃度下最大熒光強度降低，但AMIC系統(tǒng)在凍干后仍能保持其檢測靈敏度。
對于長期儲存，核糖核酸酶可以通過降解CRISPR中的crRNA削弱總體檢測性能并使用核糖核酸酶抑制劑來預(yù)防和控制污染。由于一個報告分子能在核糖核酸酶活性存在時發(fā)出熒光，RNaseAlert證實了環(huán)境和樣品中存在高水平的核糖核酸酶。經(jīng)研究表明，6 μM的核糖核酸酶抑制劑被認為是最合適的濃度。此外，冷凍干燥對加快酶活性恢復(fù)速度和提高貯藏穩(wěn)定性具有重要作用。液氮冷凍干燥獲得的微球形態(tài)與直接冷凍干燥獲得的干粉形態(tài)相比具有更好的儲存性能：微球形態(tài)（延遲3分鐘）比干粉形態(tài)（延遲5分鐘）更有利于動力學(xué)恢復(fù)，室溫下的穩(wěn)定性長達1周，這為在沒有低溫運輸條件情況下AMIC系統(tǒng)仍能快速部署提供良好的先決條件。
AMIC系統(tǒng)的易用性和可部署性優(yōu)化
為了確定目標(biāo)豐度與AMIC系統(tǒng)檢測性能之間的關(guān)系，以不同濃度（10~10? CFU/mL）的12種呼吸道細菌的人痰標(biāo)本為底物檢測相應(yīng)的信號強度。結(jié)果表明，在目標(biāo)DNA濃度低至10 CFU/mL時，AMIC系統(tǒng)仍能夠快速診斷病原體，相關(guān)系數(shù)（R）分布范圍為0.849~0.997。為了評估特異性，研究人員使用12株模型菌株和6株人類呼吸道病原體來評估AMIC系統(tǒng)的特異性。結(jié)果顯示，在相應(yīng)的檢測單元中，只有目標(biāo)菌呈陽性，其他非目標(biāo)呼吸道病原體和空白對照均呈陰性。
鮑曼不動桿菌作為臨床樣本中出現(xiàn)概率最高的菌種被用于測試AMIC系統(tǒng)對不同濃度病原體（高、中、低濃度）的可重復(fù)性。進一步研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)在多靶點檢測中可以考慮不同濃度水平，其高檢測精度保證了獲取與病原體種類和豐度相關(guān)的信息，從而可以準(zhǔn)確評估呼吸道感染的嚴重程度和用藥策略。
同時本研究采用呼吸道細菌培養(yǎng)方法和qPCR方案作為參考測試，驗證了AMIC系統(tǒng)的臨床性能。對來自呼吸道感染患者的48份人類痰樣本和來自健康人群的12份陰性樣本進行了并排檢測，結(jié)果顯示AMIC系統(tǒng)在48份培養(yǎng)方法陽性樣本中的48份（100%靈敏度）和培養(yǎng)方法陰性樣本（100%特異性）中檢測到68個靶向DNA。研究表明AMIC系統(tǒng)比qPCR檢測更靈敏，大大縮短了樣品到反應(yīng)的時間和步驟。且AMIC系統(tǒng)擅長于檢測含有多種病原體（2~6種）的樣品，從而實現(xiàn)識別可能被傳統(tǒng)培養(yǎng)方法遺漏的潛在傳染性個體。值得注意的是，該樣本組中多種病原體感染的負荷分布比一般人群的預(yù)期低20~100倍（中位負荷為~3.2 x 102 CFU/mL），這更加突顯了AMIC系統(tǒng)的臨床診斷性能。該研究分析方法正確地識別了所有陽性樣品，這證實了AMIC系統(tǒng)的臨床性能與其分析性能相當(dāng)。
在進一步研究中，本實驗將AMIC系統(tǒng)的臨床性能與兩種廣泛使用的鑒定方法Bl和MALDITOFMS（MTM）進行比較。盡管基于培養(yǎng)的Bl和MTM顯示出完美的靈敏度（~4.2x10 CFU/mL），但它們不能同時識別多種病原體且樣品到反應(yīng)的時間較長。相比之下，在患者樣品上建立的AMIC系統(tǒng)結(jié)合了高靈敏度和高通量檢測并展示了它的用戶友好性。
AMIC系統(tǒng)檢測12種呼吸道細菌的分析性能
綜上所述，本研究構(gòu)建了具有高轉(zhuǎn)換效率的RAA-CRISPR協(xié)調(diào)檢測策略，并將其集成到多路微流控芯片（AMIC系統(tǒng)）中且成功應(yīng)用于12種呼吸道細菌的同時檢測。通過調(diào)節(jié)化學(xué)反應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)，建立了等溫目標(biāo)擴增與CRISPR系統(tǒng)之間的窗口匹配，進一步增強了基于CRISPR的診斷的檢測能力，使其成為一種單一的檢測方法，而不受底物抑制的限制。將核酸提取和純化集成在AMIC系統(tǒng)的芯片上，使樣品處理在10 min內(nèi)完成，提高了核酸的利用率和整體檢測的自動化程度。采用凍干程序簡化分析工作流程，便于其運輸和儲存，同時不削弱敏感性。凍干試劑的AMIC系統(tǒng)對12種呼吸道細菌具有良好的特異性，可準(zhǔn)確定量范圍為10~10? CFU/mL。通過高通量、核酸提取和多重檢測相結(jié)合，AMIC系統(tǒng)可擴展性強，適用于臨床實驗室呼吸道病原體的檢測。該AMIC系統(tǒng)有望作為其他類型傳染病的有效工具，并可用于其他樣本類型，實現(xiàn)更全面的診斷和監(jiān)測能力。