近日，雜志Nature Communications上發(fā)表了一篇題為“Ultrasensitive single-step CRISPR detection of monkeypox virus in minutes with a vestpocket diagnostic device”的文章。作者     開發(fā)了一種使用袖珍裝置的RPA-CRISPR/Cas13a診斷系統(tǒng)SCOPE，用于在15分鐘內(nèi)對皮疹液拭子、口腔拭子、唾液和尿液樣本中的MPXV進(jìn)行即時檢測，該方法可以識別低至0.5拷貝/μL(2.5拷貝/反應(yīng))的病毒DNA。102份臨床樣本的檢測結(jié)果與qPCR相比，具有100%的靈敏度和特異性。SCOPE顯示出在資源有限的環(huán)境中使用的潛力，可以大大提高M(jìn)PXV的診斷能力。

作者開發(fā)了一種快速、超靈敏、可現(xiàn)場部署的CRISPR/Cas13a診斷系統(tǒng)SCOPE (Streamlined CRISPR On Pod Evaluation platform)，用于在皮疹液拭子、口腔拭子、唾液和尿液樣本中進(jìn)行MPXV的即時檢測。收集的樣品進(jìn)行2分鐘病毒裂解處理，然后進(jìn)行10分鐘單步RPA-CRISPR/Cas13a反應(yīng)。整個過程均在袖珍CPod中進(jìn)行。用戶只需要將采集到的樣品裝入裂解緩沖液中，并將裂解樣品轉(zhuǎn)移到單步CRISPR反應(yīng)系統(tǒng)中。SCOPE可以在資源有限的情況下在15分鐘內(nèi)檢測到MPXV，減少了操作時間和液體處理步驟。

單步RPA-CRISPR/Cas13a檢測;

單步CRISPR檢測將RPA、T7轉(zhuǎn)錄和CRISPR/Cas13a檢測在單管中進(jìn)行，避免了氣溶膠污染。通過RPA擴(kuò)增裂解的MPXV DNA，擴(kuò)增子被T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA，RNA產(chǎn)物被Cas13a和crRNA復(fù)合物識別，并激活熒光報(bào)告基因（圖a）。

對于單步CRISPR反應(yīng)，引物和crRNA的篩選顯著決定了檢測靈敏度。作者篩選了16組RPA引物，以及3種不同的靶向MPXV F3L基因的crRNA，并進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示次優(yōu)引物(F3-R1)和次優(yōu)crRNA (crRNA-3)的組合效果最好。此外，優(yōu)化結(jié)果表明，rNTP混合物濃度為1 mM、T7 RNA聚合酶濃度為1 U/uL、引物濃度為500 nM、LwaCas13a濃度為50 nM、crRNA濃度為100 nM、RNase H濃度為0.05 U/μL時表現(xiàn)最佳(圖b-g)。

無需提取的病毒裂解工藝優(yōu)化：

系統(tǒng)優(yōu)化無提取病毒滅活裂解工藝，釋放MPXV樣品的核酸，簡化樣品預(yù)處理工作流程。根據(jù)世衛(wèi)組織的說法，最好的診斷標(biāo)本是直接從皮疹(皮膚、液體或結(jié)痂)上取的拭子，也可選擇口咽、肛門或直腸拭子，不建議進(jìn)行血液檢查。溫度和時間是病毒裂解的兩個關(guān)鍵參數(shù)。最終選擇了80℃孵育2 min作為最佳裂解條件。此外還確定了裂解緩沖液與樣品的最佳比例為皮疹液拭子為9:1，口腔拭子為3:1，唾液為1:3，尿液為9:1，且使用7μL的裂解樣品時反應(yīng)效率最佳。直接裂解法對皮疹液拭子、口腔拭子和唾液標(biāo)本的核酸提取結(jié)果與傳統(tǒng)的核酸提取方法相似(圖t-v)，但由于尿樣成分復(fù)雜，裂解效果明顯低于核酸提取(圖w)。

袖珍分析裝置的制造：

設(shè)計(jì)并制造了一種小型化、低成本、用戶友好且多功能的自制設(shè)備，以適應(yīng)上述基于CRISPR的檢測實(shí)驗(yàn)(圖a,b)。金屬陶瓷加熱器和PT1000溫度傳感器由ESP32微控制單元進(jìn)行控制。此外，在裂解溫度(80°C)至CRISPR反應(yīng)溫度(37°C)時，增加了冷卻風(fēng)扇以加快冷卻速度。在CPod中使用了低成本，微小且敏感的光譜傳感器AS7341，集成了8個可見光通道和1個近紅外光譜通道，可以滿足多路檢測的要求。最終診斷可以以兩種不同的模式呈現(xiàn)，對于獨(dú)立模式(易于使用模式)，可以通過指示燈通過肉眼讀取結(jié)果。對于無線控制模式(專業(yè)模式)，CPod與智能手機(jī)無線連接，收集的實(shí)時熒光強(qiáng)度可以在內(nèi)部設(shè)計(jì)的智能手機(jī)應(yīng)用中顯示。整個CPod由USB Type-C電源適配器供電。光學(xué)，機(jī)械和電子組件的總成本為13.46美元。由于它不需要任何外部設(shè)備，是一種靈活和通用的解決方案，以滿足日益增長的分子診斷需求。這種小型化、簡單易用、低成本的設(shè)備在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中具有很大的應(yīng)用前景。

SCOPE用于MPXV檢測的分析性能：

病毒核酸的檢出限(LoD)對于早期篩查至關(guān)重要。作者分別在CPod和熒光酶標(biāo)儀上測試單步RPA-CRISPR/Cas13a檢測方法的LoD (圖a-c)。CPod測得的LoD為0.5 copies/μL (2.5 copies/reaction)，與酶標(biāo)儀測得的LoD一致。幾種正痘病毒和其他類似癥狀的病毒，包括牛痘、天花、單純皰疹病毒(HSV)和水痘，經(jīng)MPXV檢測驗(yàn)證無交叉反應(yīng)性(圖f)，從而表明此檢測系統(tǒng)具有良好的特異性。

MPXV臨床樣品驗(yàn)證：

為了研究SCOPE的臨床適用性，作者收集了102份臨床樣本，包括35份Mpox陽性樣本(9份皮疹液拭子樣本、9份口腔拭子樣本、9份唾液樣本和8份尿液樣本)，19份HSV樣本(5份皮疹液拭子樣本、5份口腔拭子樣本、4份唾液樣本和5份尿液樣本)，以及48份健康男性陰性樣本(12份皮疹液拭子樣本、12份口腔拭子樣本、12份唾液樣本，以及12份尿液樣本)，并與qPCR法并排進(jìn)行SCOPE檢測。提取病毒的qPCR總共花了將近2小時，而基于SCOPE的病毒裂解只花了15分鐘。qPCR檢測MPXV陽性樣本的Ct值范圍為15.88 ~ 39.02。SCOPE以100%的靈敏度和100%的特異性正確識別了所有102例臨床樣本(圖c)，與qPCR結(jié)果100%一致(圖d, e)，表明本文提出的SCOPE用于MPXV檢測與金標(biāo)準(zhǔn)qPCR相比具有競爭力的檢測性能，但反應(yīng)速度更快，用戶操作更少，現(xiàn)場可部署能力更強(qiáng)。

總結(jié)：

最近爆發(fā)的COVID-19和Mpox等傳染病流行突出了快速、敏感、準(zhǔn)確的核酸POCT技術(shù)在家庭自檢或現(xiàn)場流行監(jiān)測中的必要性和重要性。新興的CRISPR-Dx檢測技術(shù)具有實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的巨大潛力。然而，大多數(shù)現(xiàn)有的CRISPR- dx檢測方法使用核酸預(yù)擴(kuò)增和CRISPR反式切割兩步檢測，這可能導(dǎo)致復(fù)雜的工作流程和氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)。本研究開發(fā)了一種低成本的基于CRISPR的POCT平臺，采用一種簡化的病毒裂解方法，可在2 min內(nèi)快速有效地從樣本中釋放核酸。CPod可以執(zhí)行所有檢測程序，而無需使用任何額外的儀器。在從樣品輸入15分鐘內(nèi)檢測到低至0.5拷貝/μL(2.5拷貝/反應(yīng))的MPXV，其檢測性能與qPCR相當(dāng)，但速度更快，工作流程簡化，現(xiàn)場可部署能力更強(qiáng)。

一些進(jìn)一步的改進(jìn)可以使之更適用于護(hù)理點(diǎn)的需求。在目前的工作流程中，需要80°C加熱2 min才能釋放病毒核酸。應(yīng)優(yōu)化裂解緩沖液和反應(yīng)時間，以在室溫下實(shí)現(xiàn)高效的病毒裂解。此外，可以設(shè)計(jì)一種“進(jìn)樣、出樣”的微流控芯片，將樣品裂解、溶液轉(zhuǎn)移和RPA-CRISPR反應(yīng)完全集成在一起。此外，該分析僅使用從男性患者收集的樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，因此還需要大量臨床驗(yàn)證?？傊琒COPE將成為MPXV或其他病原體即時檢測的有力工具。這種快速、超靈敏的單步RPA-CRISPR檢測可以很容易地與當(dāng)前基于Cas13a的技術(shù)相結(jié)合，促進(jìn)CRISPR-Dx領(lǐng)域的實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

相關(guān)產(chǎn)品;

RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列