產(chǎn)品信息：

產(chǎn)品簡介

        Zeocin是腐草霉素D1（Phleomycin D1）的商業(yè)名稱，其中文名稱博來霉素是一種銅離子螯合的糖肽抗生素（來源于鏈霉菌Streptomyces verticillus的突變株），銅離子的存在使其呈藍色，此銅螯合的形式為無活性。當抗生素進入細胞后，二價銅離子（Cu2+）被還原為一價銅離子（Cu+），并被細胞內(nèi)的巰基化合物去除。銅離子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其斷裂，最終導致細胞死亡。博來霉素是作用譜廣泛，對細菌、真核微生物、植物和哺乳動物細胞具很強的毒性。博來霉素常用作一種非常有效的工具抗生素，用來篩選攜帶Sh ble抗性基因并能穩(wěn)定表達分子量為13.665 kDa的一種博來霉素抗性蛋白的細胞株。博來霉素是的用量為 50-2000 ug/ml（通常 300 ug/ml），具體取決于細胞類型。

提供無菌溶液形式的Zeocin，濃度是100mg/ml，使用起來更加方便，只需直接加入培養(yǎng)基到所需工作濃度即可。

產(chǎn)品性質(zhì)

分子式（Formula）：C55H85O21N20S2Cu - HCl

Cas: 11006-33-0

分子量（Molecular Weight）：1535

外觀（Appearance）：藍色粉末

內(nèi)毒素：＜1 EU/mg

純度（Purity）：>90%(HLPC)

溶解性：易溶于水（>500 mg/ml）

應用參考濃度：

1）大腸桿菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過5g/L）

2）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養(yǎng)基）

3）哺乳動物細胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養(yǎng)基，根據(jù)細胞系而不同）

使用步驟參考

一、細胞對Zeocin敏感性的確定（殺滅曲線建立）

重新鋪板或者將滿盤細胞重新分盤，使得細胞密度約25%，按照8個平板/組準備，培養(yǎng)24h，去除舊培養(yǎng)基。

加入含不同濃度Zeocin的篩選培養(yǎng)基，Zeocin濃度可設(shè)置為0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每個濃度做3個平行；也可根據(jù)自身實驗體系，設(shè)置不同的濃度梯度。

每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細胞的比例。選擇在合適時間（1-2周內(nèi)）殺死大多數(shù)細胞的濃度為最加工作濃度。【注】：若是難以在顯微觀察下區(qū)分活細胞，建議使用臺盼藍染色來計算存活細胞的數(shù)量，以確定Zeocin的最適濃度。

二、篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系

轉(zhuǎn)染細胞，用100mm培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染的細胞作為陰性對照。

轉(zhuǎn)染后，用預熱的1X PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)基。

轉(zhuǎn)染48-72h后，用含有最加濃度Zeocin（由滅殺曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基篩選細胞。為了更好的鑒定和篩選細胞集落，建議將細胞按比例稀釋成一系列濃度。

【注】：若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞，按照以下方法克服此類耐性：用含Zeocin培養(yǎng)基進行細胞分盤，置于37°C孵育2-3h，使得細胞貼壁。然后將細胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為培養(yǎng)基的緩沖體系。重新將細胞置于37°C孵育。4°C孵育細胞的目的是短時間內(nèi)終止細胞分化，使得Zeocin能發(fā)揮作用，殺死細胞。

每3-4天更換新鮮的選擇培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)細胞集落。

挑選并轉(zhuǎn)移克隆到96或48孔板中。在進行更大孔徑培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上擴大培養(yǎng)之前，確保培養(yǎng)細胞密度近100%。

三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的維持培養(yǎng)

可采取以下方式維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞：

1）使用含相同劑量Zeocin的篩選培養(yǎng)基來維持培養(yǎng)；

2）降低Zeocin劑量為原來的一半進行維持培養(yǎng)；

3）使用正好能預防敏感細胞生長但不足以致死的Zeocin劑量來維持培養(yǎng)【根據(jù)殺滅曲線來判斷】。