產(chǎn)品簡(jiǎn)介

ChIP-Seq是一種用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和組蛋白翻譯后修飾的全基因組識(shí)別的強(qiáng)大工具，但其固有的半定量性質(zhì)可能會(huì)限制研究人員在某些情況下比較樣本之間差異的能力(在本網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)中有更詳細(xì)的描述)。然而，通過(guò)在ChIP反應(yīng)之前向樣品中“插入”少量外源性染色質(zhì)，您可以在最終測(cè)序數(shù)據(jù)中將從實(shí)驗(yàn)樣品到對(duì)照的信號(hào)正?；?。這種方法使研究人員對(duì)樣本間比較的準(zhǔn)確性比以往任何時(shí)候都更有信心。
Spike-In歸一化如何改進(jìn)ChIP-Seq分析?
一個(gè)特別引人注目的例子說(shuō)明了ChIP-Seq標(biāo)準(zhǔn)化的重要性，在實(shí)驗(yàn)中研究了抑制性組蛋白標(biāo)記H3K27me3在表觀遺傳抑制劑存在下的全基因組定位。H3K27me3有一個(gè)鑒定的甲基轉(zhuǎn)移酶(EZH2)，負(fù)責(zé)催化甲基的加成。然而，在ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)中，EZH2抑制似乎沒(méi)有顯著影響H3K27me3水平(圖1中前兩個(gè)軌道)。
ChIP Spike-in標(biāo)準(zhǔn)化優(yōu)勢(shì)
減少技術(shù)變化的影響
檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)ChIP分析未觀察到的細(xì)微生物學(xué)差異
是否可以應(yīng)用于不同的抗體和樣品而不存在偏見(jiàn)
Spike-in染色質(zhì)和Spike-in抗體可用于任何ChIP試劑盒或協(xié)議
Strategy同時(shí)適用于qPCR和ChIP-Seq分析
ChIP-Seq Spike-In如何工作?
ChIP歸一化可以簡(jiǎn)單地通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)和感興趣的抗體將我們的Spike-in試劑成到您的標(biāo)準(zhǔn)ChIP協(xié)議中輕松實(shí)現(xiàn)。Spike-in染色質(zhì)和Spike-in抗體也被添加到ChIP反應(yīng)中，作為IP反應(yīng)的一小部分。在ChIP反應(yīng)過(guò)程中引入的任何變化也會(huì)發(fā)生在Spike-in染色質(zhì)上。由于所有樣品中插入染色質(zhì)的數(shù)量是一致的，因此可以根據(jù)插入信號(hào)創(chuàng)建歸一化因子，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)信號(hào)。
下圖描述了如何輕松地將Spike-in染色質(zhì)和Spike-in抗體集成到現(xiàn)有的ChIP-Seq工作流程中。在免疫沉淀之前，將Spike-in染色質(zhì)和Spike-in抗體添加到實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)和實(shí)驗(yàn)抗體中。Spike-in Antibody識(shí)別特定于Spike-in染色質(zhì)(果蠅)物種的組蛋白變體，而實(shí)驗(yàn)抗體專門(mén)識(shí)別實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)。這使得特異性檢測(cè)刺入染色質(zhì)沒(méi)有任何顯著增加的背景信號(hào)。在測(cè)序之后，測(cè)序結(jié)果將被映射到它們的特定物種上。ChIP過(guò)程中引入的變異將以與實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)相同的方式影響Spike-in染色質(zhì)，因此可以從Spike-in染色質(zhì)中創(chuàng)建一個(gè)歸一化因子，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)，以歸一化技術(shù)變異和樣本偏差，或監(jiān)測(cè)生物學(xué)效應(yīng)。
圖2:ChIP-Seq標(biāo)準(zhǔn)化工作流程。
使用實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)(如人)和感興趣的抗體建立標(biāo)準(zhǔn)ChIP反應(yīng)。此外，黑腹果蠅的染色質(zhì)被添加到每次反應(yīng)中，作為總?cè)旧|(zhì)的一小部分。一種識(shí)別果蠅特異性組蛋白變體H2Av的抗體被添加到反應(yīng)中。Spike-in Antibody提供了一種機(jī)制，可以可靠地拉下所有樣本中一致的一小部分果蠅染色質(zhì)。在ChIP測(cè)序之后，數(shù)據(jù)被映射到果蠅基因組和實(shí)驗(yàn)基因組上。根據(jù)果蠅標(biāo)簽計(jì)數(shù)，為每個(gè)樣本創(chuàng)建一個(gè)歸一化因子。實(shí)驗(yàn)標(biāo)記數(shù)用相同的因子歸一化
ChIP插針?lè)磻?yīng)指南
每批Spike-in染色質(zhì)都用Spike-in Antibody進(jìn)行量化和測(cè)試。這使我們能夠推薦適當(dāng)數(shù)量的刺入染色質(zhì)用于您的反應(yīng)。最小數(shù)量的Spike-in染色質(zhì)是準(zhǔn)確歸一化樣本所必需的，但Spike-in讀取應(yīng)不超過(guò)測(cè)序運(yùn)行的5%。下表是所提建議的一個(gè)例子。每批貨物都附有一份具體的數(shù)據(jù)表，說(shuō)明推薦的刺入染色質(zhì)的數(shù)量。
ChIP-Seq插入規(guī)范化內(nèi)容
請(qǐng)注意ChIP歸一化試劑可單獨(dú)購(gòu)買。Spike-in染色質(zhì)和Spike-in抗體都需要應(yīng)用歸一化策略?？衫霉壧禺愋詑PCR引物組進(jìn)行ChIP qPCR分析。
在抗體
50μg Spike-in Antibody，在含0.035%疊氮化鈉和30%甘油的PBS中以1μg/μl的濃度供應(yīng)。Spike-in Antibody在室溫下裝運(yùn)。這不會(huì)影響試劑的穩(wěn)定性或性能。收到后，儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
在染色質(zhì)
從Schneider’s Drosophila Line 2 (S2)細(xì)胞制備的Spike-in染色質(zhì)提供了15個(gè)rxns的穩(wěn)健組蛋白修飾抗體靶點(diǎn)。Spike-in染色質(zhì)濃度為10 ng/μl。
qPCR引物組
400 μ l果蠅陽(yáng)性對(duì)照引物組Pbgs以2.5 μ M的濃度供應(yīng)
400μl果蠅陰性對(duì)照引物Set 1以2.5μM的濃度供應(yīng)
ChIP-Seq插入規(guī)范化數(shù)據(jù)
減少技術(shù)變化的影響
ChIP歸一化策略是理想的糾正由于樣品丟失、擴(kuò)增偏置、測(cè)序讀取深度不均勻或用戶之間的手對(duì)手差異造成的差異。通過(guò)利用在具有Spike-in染色質(zhì)的樣品之間觀察到的差異，創(chuàng)建了一個(gè)歸一化因子，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)樣品，以歸一化技術(shù)變化的影響。
識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)芯片分析未觀察到的生物差異
通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)的CIP反應(yīng)中加入Spike-in Chromatin和Spike-in Antibody，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以適應(yīng)樣品的變化。這種歸一化使得更容易監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件的影響，例如抑制化合物或突變體，以揭示生物學(xué)差異
。hIP-Seq中生物學(xué)差異的歸一化。
ChIP-Seq對(duì)未處理的細(xì)胞和用EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶小分子抑制劑處理的細(xì)胞進(jìn)行。使用標(biāo)準(zhǔn)的ChIP-Seq分析(-)檢測(cè)不到信號(hào)的差異。引入峰值歸一化策略(+)揭示了H3K27me3 ChIP-Seq信號(hào)的預(yù)期下降，證實(shí)了歸一化策略在檢測(cè)生物變化方面的價(jià)值。
檢測(cè)特異性
Spike-in染色質(zhì)由Schneider’s Drosophila Line 2 (S2)細(xì)胞制備的黑腹果蠅染色質(zhì)組成。Spike-in抗體識(shí)別果蠅特異性組蛋白變體H2Av。由于Spike-in Antibody對(duì)Spike-in染色質(zhì)修飾的特異性，與哺乳動(dòng)物樣品沒(méi)有交叉反應(yīng)，導(dǎo)致背景信號(hào)降低。
:Spike-in抗體的特異性。
Spike-in Antibody與哺乳動(dòng)物樣品的交叉反應(yīng)性最小。當(dāng)Spike-in Antibody在ChIP-Seq中與人染色質(zhì)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，幾乎沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。這說(shuō)明了峰值規(guī)范化策略的特殊性