D-熒光素專題

原理

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍應用于整個生物技術領域，尤其是體內(nèi)活體成像技術。其作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素（底物）能夠被氧化發(fā)光。當熒光素過量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關性（見下圖）。

將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉染入細胞后，導入研究動物如大、小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過生物發(fā)光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監(jiān)測疾病發(fā)展狀態(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強度的變化來指示能量或生命體征。

分類

使用方法

（1）體外實驗：

a：儲存液配置：將1 g的熒光素鈉鹽或鉀鹽溶解于33.3 ml水中，制備成30 mg/ml的儲存液?；靹?，0.2μm濾膜過濾（可吹入惰性氣體，如氮氣，以防止氧化。）-80℃避光保存，一年內(nèi)有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍，可短暫溫浴，并輕柔混勻）。②用培養(yǎng)基以1:200的比例稀釋儲存液為150μg/ml。③去除培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基直至無殘留。④待圖像分析前，向細胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析（或者細胞放在37℃短時間孵育約5min后檢測可增強信號）

（2）活體成像：

a：工作液配置：①溶解1 g熒光素鉀鹽或鈉鹽于66.6 ml 無Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS中，配置成15 mg/ml的溶液。②混勻，0.2μm濾膜過濾（可吹入惰性氣體，如氮氣，以防止氧化。）-80℃避光保存，一年內(nèi)有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍，可短暫溫浴，并輕柔混勻）。

②按照動物體重150 mg/kg進行注射，（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）

③注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號達到最強穩(wěn)定平臺期），再進行成像分析。

注：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。

注射方法

（1）腹腔注射：

將底物注射入腹腔中。推薦劑量為150 mg/Kg（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）。使用25 G的針頭，1 ml注射器。

其方法如下示意圖：

進針5 mm，斜向上30^°角。

（2）靜脈注射：

小鼠的靜脈注射通常是在小鼠的尾部或者眼眶靜脈注射。靜脈注射的推薦劑量同腹腔注射，150 mg/Kg。注射液體的最大體積不可超過血容量的10%。一般對于20 g 小鼠其血容量為2 ml，故其最大注射量應為200μl。使用1 ml注射器26 G針頭，或者使用胰島素注射器28 G針頭，確保注射器中無氣泡。注射前將動物置于加熱燈下約5 min，或者將尾巴浸泡于溫水中以擴張血管。操作時將小鼠固定于鼠筒或者燒杯中，乙醇消毒尾部，緩慢注射。

客戶實例

TIPE2抗炎因子在乳腺癌動物模型中的抗腫瘤治療作用

選自文獻：Zhang Z, Li L, Cao S, et al. Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8 +, T and NK cell-mediated antitumor responses[J]. Molecular Immunology, 2017, 85:230.

FAQ

Q1: 熒光素的純度對實驗有成影響嗎？

A：有影響。99%以上的純度較好。

Q2: 甲蟲熒光素和螢火蟲熒光素之間有區(qū)別嗎？

A：二者之間沒有區(qū)別。

Q3: 如何溶解熒光素，其溶液穩(wěn)定嗎？

A：熒光素鉀鹽在水中的溶解度為60 mg/ml，熒光素鈉鹽溶解度為100 mg/ml。熒光素游離酸是不溶于水的，但是在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml。

熒光素鈉鹽和鉀鹽的水溶液短期內(nèi)存放于-80℃，對實驗效果沒有明顯影響。有實驗證明，將熒光素溶解于脫氧中的水中會更穩(wěn)定些。

對于一些較為敏感的試驗，為了控制試驗中的可變因素，較推薦新鮮配置的反應液 。例如，低濃度的熒光素酶或者并非最適的反應條件是需要高質(zhì)量的底物才能進行反應  。

Q4: 熒光素鈉鹽和熒光素鉀鹽有什么區(qū)別？

A：目前的研究沒有發(fā)現(xiàn)二者在使用效果上的區(qū)別，僅在物理特征上有些小的差別，如熒光素鈉鹽溶解度會高于熒光素鉀鹽。但是在體內(nèi)實驗研究中，有更多的研究者傾向于選擇熒光素鉀鹽，據(jù)不完全統(tǒng)計，選用鉀鹽的使用人是鈉鹽使用人的3倍。

Q5: 熒光素鈉鹽，熒光素鉀鹽，和熒光素游離酸之間有什么區(qū)別？

A：游離酸不溶于水，在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml，同樣可用 NaOH，KOH弱堿去調(diào)節(jié)溶液的PH值。熒光素的鈉鹽或者鉀鹽在使用過程中會更方便，尤其是在體內(nèi)成像實驗中，因其能夠溶解在水中，反應毒性也會更小些。

Q6: 為什么溶解熒光素鈉鹽或者鉀鹽的時候需用不含Ca2+或Mg2+離子的PBS，有無別的鹽溶液可用來溶解熒光素？

A：PBS，或者其他的磷酸鹽緩沖液，或DPBS，常用來進行生物學研究或者細胞相關研究。PBS/DPBS為等滲溶液，PH為7.2-7.6之間。DPBS和PBS之間無差別，只是通常情況下，DPBS是不含鈣鎂離子。鈣鎂離子可能會抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg²⁺是催化熒光氧化的重要因素，Ca²⁺是和腔腸素氧化有關的離子。其他的鹽溶液也可用來溶解熒光素，但要避免溶液中的陽離對實驗造成影響。

Q7: 熒光素酶的發(fā)光特性？

A：熒光素腹腔注射老鼠后約1 min后，能夠表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，10 min后強度達到穩(wěn)定的最高點，在最高點持續(xù)約20-30 min后開始衰減，約3 h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，最好的檢測時間是在注射后15-35 min內(nèi)。其動力學曲線如下圖：

Q8: 怎么將熒光素注入小鼠體內(nèi)，注射方法之間的區(qū)別是什么？

A：熒光素可通過腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內(nèi)。約1 min可擴散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg。對于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可。對于腹腔注射來講，擴散較慢，開始發(fā)光較慢，持續(xù)發(fā)光時間較長。對于熒光素的尾部靜脈注射，擴散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間較短。

Q9: 熒光素底物可以透過血腦屏障嗎？

A：熒光素底物約280道爾頓，熒光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

Q10: 熒光素酶的表達穩(wěn)定性如何？

A：通過穩(wěn)定篩選等過程，熒光素酶基因是能夠插到細胞染色體內(nèi)的。當細胞進行分裂、轉移、分化時，熒光素酶也得到持續(xù)穩(wěn)定的表達，熒光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細胞才能持續(xù)表達熒光素酶。

注意：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。保存和操作的過程中都要避光。另外水溶性儲存液過濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復凍融。如果有條件，對儲存液充氮氣或氬氣（防止氧化），穩(wěn)定性和保存時間更長，長達1年。 注射方式，動物類型以及體重等都會影響信號的發(fā)射，因此建議每次實驗都要做熒光素酶動力學曲線，確定最佳信號平臺期和最佳的檢測時間。熒光素鉀鹽和熒光素鈉鹽應用上沒有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發(fā)表的文獻來看，鉀鹽的使用率遠高于鈉鹽，尤其是體內(nèi)實驗。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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