鈣離子載體/探針（Calcium Ionophores/Indicators）—————專題

    鈣離子是機體的重要元素，同時作為細胞內第二信使通過與鈣調蛋白（Calmodulin，CaM）結合激活多種蛋白激酶（如腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶、鈣調蛋白激酶等）及諸多蛋白水解酶和核酸酶，從而參與包括細胞代謝、細胞周期等多種細胞功能的調節(jié)，在細胞的許多生命活動中擔當著重要的角色。因此，鈣離子測定在醫(yī)學實驗研究中有著重要意義。

鈣離子測定技術得益于兩種近代實驗技術，一是鈣激活蛋白及熒光指示劑（或稱熒光探針），二是熒光檢測及成像分析，這些技術的日臻成熟使我們能夠觀察到許多與鈣離子濃度變化有密切關系的亞細胞現(xiàn)象。近年來，數(shù)字CCD成像熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、多光子掃描顯微鏡、流式細胞儀等技術的發(fā)展，使我們不但能夠精確地測定出鈣離子濃度的變化，還可以得出準確的亞細胞水平空間定位。

鈣離子濃度變化是活細胞接受外界刺激后產生級聯(lián)反應的重要信息傳遞方式，因此細胞內鈣離子檢測是信號轉導G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）介導的相關藥物篩選以及其他相關實驗中非常重要的一種研究手段，該領域中常使用鈣離子熒光探針與鈣離子的特異性結合來觀察細胞內鈣離子濃度水平的變化，此類探針未結合Ca2+前幾乎無熒光，結合Ca2+后，熒光強度顯著增強，所顯示光譜可被熒光顯微鏡、流式細胞術、熒光光譜法以及熒光酶標儀等多種方法檢測。

細胞內鈣離子濃度的變化能觸發(fā)細胞凋亡，下述兩款鈣離子熒光染料被廣泛使用，它們具有細胞透性，因此可以染活細胞。它們與鈣離子結合后熒光強度大大提高，可用于流式細胞術、免疫熒光和熒光色譜分析。

 FURA-2是細胞內鈣離子（Ca2+）的特異性熒光指示劑，由Grynkiewicz等于1985年合成。它能特異性地與Ca2+結合，結合比例為1:1同時發(fā)出熒光，結合Ca2+后的最大激發(fā)波長從結合前的380nm移向340nm，其發(fā)射熒光強度與結合Ca2+的濃度有定量關系。由于FURA-2是極性大的酸性化合物，無法進入細胞內，為此在其負性基團上結合了乙酰氧甲酯，使其成為FURA-2-AM．既增加了酯溶性又消除了負電荷，使之容易進入細胞內，在細胞內被酯酶水解成FURA-2后可與胞漿游離Ca2+可逆性結合。但FURA-2-AM在細胞外并不能與Ca2+結合，所以檢測的340nm激發(fā)下的發(fā)射熒光強度可定量的確定胞內Ca2+濃度及其動態(tài)變化。

一. FURA-2

Fura-2是由紫外光激發(fā)的，一般用340nm以及380nm處激發(fā)它產生的熒光比值（510 nm處檢測）表示鈣離子的濃度。

        FURA-2的特點

        1) 熒光強度大，敏感度高，且所用劑量小，對細胞內環(huán)境影響?。?span>

        2) FURA-2測定[Ca2+]基本不受細胞密度及熒光劑濃度的影響，易于識別與計算；

        3) 對鈣的選擇性高；

        4) 自身熒光小；

        5) FURA-2與Ca2+結合的解離常數(shù)(Kd) 37℃為224，其標準曲線具有良好的線性，其對Ca2+的測定范圍為10-5～10-82 mol/l，且能測定短暫而快速的Ca濃度的變化。

FURA-2的應用：它主要應用于兩個方面，一是將FURA-2直接注入單個細胞內，用熒光顯微鏡觀測Ca2+染色；二是測定細胞懸液、組織塊或貼壁細胞的細胞內Ca2+濃度。

左圖：REF-52成纖維細胞用FlCRhR處理后，用FURA-2染色。第一行顯示cAMP變化，第二行FURA-2染色顯示CA2+變化。1-4列分別為對照、處理0分鐘、17分鐘和38分鐘的熒光圖象。結果顯示，胞內cAMP誘導的FICRhR C亞基增多（FITC標記），但Ca2+濃度變化不大。該文章發(fā)表在Proc Natl Acad Sci USA 93, 4577(1996)。

二.Fluo-4 

Fluo-4 是一種將Fluo-3結構中的Cl替換成F的鈣熒光探針。由于將Cl替換成了電子吸引力更強的F，它的最大激發(fā)波長會向短波長處偏離10 nm左右。這個波長更接近于氬激光器的波長，所以用氬激光器激發(fā)時，Fluo-4的熒光強度比Fluo-3強1倍。由于Fluo-4與鈣離子的親和力和Fluo-3近似(Fluo-3: Kd=0.4 umol/l、Fluo-4: Kd=0.36 umol/l)，所以使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀等儀器檢測細胞內鈣離子濃度的變化。Fluo-4-AM是Fluo-4的一種乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易進入細胞中。AM進入細胞后會被胞內酯酶所水解，產生的Fluo-4隨后會和鈣離子結合并發(fā)出熒光。

上圖是以9秒間隔連續(xù)拍攝而成。該細胞首先用50 mM KCl去極化處理 (2)，然后用離子載體ionomycin 5 uM處理 (8)。該照片由熒光顯微鏡成像，再由冷CCD拍照而成。后期處理將濃度差異轉化為顏色差異，紅色表示高濃度鈣離子，藍色表示低濃度鈣離子。

常用的Ca2+熒光探針根據(jù)波長的不同，分為兩大類：

第一類：可見光激發(fā)Ca2+熒光探針

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發(fā)Ca2+探針具有以下特點：

1）適用于大多數(shù)的激光共聚焦測鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。

2）具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化，從而降低了對活細胞的光毒性。

3）Ca2+依賴性熒光強度增強，對Ca2+變化水平檢測敏感度更高。

4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測。5）無光譜偏移。

介紹幾種最受歡迎的可見光激發(fā)Ca²⁺熒光探針：

1）Fluo-3

Fluo-3是最常用的可見光激發(fā)Ca²⁺熒光探針，較高的Ca²⁺結合力可捕捉細胞內Ca²⁺信號的動力學變化，使用于多種流式細胞術相關實驗，如籠鎖Ca²⁺螯合劑光活化、第二信使、神經傳導物質研究以及細胞水平的藥物篩選等。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。但是，當它與細胞內鈣離子結合后可以產生較強的熒光，熒光會增加60至100倍，最大激發(fā)波長為 506nm，最大發(fā)射波長為 526nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525～530nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化。

2）Fluo-4

Fluo-4是鈣指示劑Fluo-3的升級版本，主要變化為后者分子上的兩個氯原子被Fluo-4上的氟所取代，該結構上的微小變化使Fluo-4,AM加載更快，在相同濃度下檢測信號更強。

3）Rhod-2

Rhod-2是另一種可見光激發(fā)的高親和力Ca²⁺指示劑，與其他可見光激發(fā)熒光探針如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有長波長，更適用于檢測具有較高自熒光現(xiàn)象的細胞和組織內鈣離子水平以及檢測由光感受器和籠鎖Ca²⁺螯合劑光激活導致的鈣離子釋放。

圖 Fluorescence emission spectra at equal concentrations of fluo-4 (blue) and fluo-3 (red) in solutions containing 0–39.8 μM free Ca²⁺.

你所不知道的秘密：為什么許多熒光探針會有R-AM或者R的形式提供？以Fluo-4或Fluo-4, AM為例。

常規(guī)的熒光探針如Fluo-4屬極性大的酸性化合物，無法進入細胞內。此時，若想做細胞內染色，需要通過膜片微電極（patch pipette），顯微注射（microinjection），胞引作用加載試劑等手段，輔助實現(xiàn)藥物加載，何其麻煩??！

為此，而通過在Fluo-4的負性基團上結合乙酰氧甲酯（AM），該單一的變化既增加了酯溶性又消除了負電荷，極大的提高了細胞滲透性。只需要把細胞孵育在含藥物的培養(yǎng)液中，即可實現(xiàn)加載，非常省事。而一旦Fluo-4 AM進入細胞后，酯化鈣離子熒光探針被酯酶水解，恢復Fluo-4，在胞內完全發(fā)揮其正常生理功能。

第二類：紫外光激發(fā)Ca²⁺熒光探針

Fura-2和Indo-1均屬可見光激發(fā)Ca²⁺熒光指示劑，也是目前最常用的比率測量熒光探針。與第一代染料Quin-2相比，Fura-2和Indo-1發(fā)出更強的熒光，在生理pH范圍內對pH變化不敏感。與Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二價金屬離子相比，對Ca²⁺有更高的選擇性，因此得到了廣泛應用，同時作為雙波長熒光染料在標定Ca²⁺濃度時不再單純依靠熒光強度的變化。

1）Fura-2

2）Indo-1

Fura-2是雙激發(fā)波長熒光染料，Indo-1是雙發(fā)射波長熒光染料，均采用比率測量方法，該方法可以消除不同細胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2特別適合于數(shù)字成像顯微鏡，使用該設備可更方便的調整激發(fā)波長，使探針結合鈣離子后在300-400nm的激發(fā)波長范圍內掃描Fura-2的吸收偏移，在510nm處檢測發(fā)射波長。相比之下，Indo-1更傾向于流式細胞術檢測，使用該設備可實現(xiàn)在氬離子激光器的351-364光譜范圍內單一波長的激發(fā)，在400nm和480nm的波長處分別檢測結合鈣離子和未結合鈣離子的熒光信號，通過二者的比值確定鈣離子的濃度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分別是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活細膜滲透性。

相關產品：