細胞培養(yǎng)常見問題分析

??培養(yǎng)細胞生長緩慢

可能原因

1.由于更換不同培養(yǎng)液或血清；

2.培養(yǎng)液中一些細胞生長必須成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞；

3.培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染；

4.試劑保存不當(dāng)；

5.接種細胞起始濃度太低；

6.細胞已老化；

7.支原體污染。

解決方法

1.比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗，讓細胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；

2.換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補加谷氨酰胺及生長因子；

3.用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物；

4.血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完；

5.增加接種細胞起始濃度；

6.換用新的保種細胞；

7.分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

??污染

1. 支原體污染；

2. 霉菌污染。

培養(yǎng)基或血清

1. 更換血清或培養(yǎng)基之前未進行驗證；

2. 選擇的培養(yǎng)基是否合適；

3. 培養(yǎng)基配制是否合適；

4. 培養(yǎng)基配制是否準確無誤。

??培養(yǎng)環(huán)境

1. CO2供應(yīng)是否正常；

2. 培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。

解決方法

根據(jù)以上四個方面的可能原因，做出針對性的解決方案

1.注意細胞的本身狀態(tài)：如傳代次數(shù)，接種量等；

2.避免產(chǎn)生污染（用正規(guī)，合法，可朔源的血清）；

3.要用合適的血清或培養(yǎng)基，最好經(jīng)過驗證；

4.注意實驗室的環(huán)境。

??培養(yǎng)細胞死亡

可能原因

1.培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2；

2.培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大；

3.細胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷；

4.培養(yǎng)液滲透壓不正確；

5.培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積。

解決方法

1.檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2；

2.檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度；

3.取新的保存細胞種；

4.檢測培養(yǎng)液滲透壓；

5.換入新鮮培養(yǎng)液；

??培養(yǎng)細胞不貼壁

可能原因

1.胰蛋白酶消化過度；

2.支原體污染；

3.培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）；

4.細胞老化；

5.接種細胞起始濃度太低或太高。

解決方法

1.縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度；

2.分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物；

3.使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2；

4.啟用新的保種細胞；

5.調(diào)節(jié)最佳接種細胞濃度。

??懸浮細胞成簇

可能原因

1.培養(yǎng)液中含鈣,鎂離子；

2.支原體污染；

3.蛋白酶過度消化使得細胞裂解；

4.DNA污染。

解決方法

1.用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕巧吹吸2.細胞獲得單細胞懸液；

3.分離培養(yǎng)物，檢測支原體；

4.DNasel處理細胞。

BI品牌特級胎牛血清優(yōu)勢：

1. 指標好，內(nèi)毒素低，利于細胞的生長，不會導(dǎo)致細胞過早的凋亡，有利于下游產(chǎn)物的純化，其他重要指標都處于國際一流水平，檢測方法完全符合國際標準或美國藥典。

2. 品質(zhì)有保證，BI公司的血清生產(chǎn)完全符合cGMP的生產(chǎn)要求，并通過了ISO13485: 2003和ISO9001: 2008質(zhì)量認證，符合USDA標準，并有歐洲藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的EDQM證書，可以用于制藥行業(yè)。

3. Biological Industries（BI）血清種類齊全，可以滿足所有血清用戶的需求。

4. BI品牌的多種血清都提供了熱滅活的包裝，減少了實驗室自行熱滅活的工作，并最大限度降低了熱滅活對血清的負面影響。

5. 胚胎干細胞專用血清及TET系統(tǒng)專用血清都經(jīng)過相關(guān)實驗嚴格篩選及驗證，出售的FBS原料來源于根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織（OIE）認可的未發(fā)生瘋牛病BSE）疫情的國家，確保其質(zhì)量安全。

1、 特級胎牛血清

BioInd特級胎牛血清經(jīng)過3次100nm過濾，內(nèi)毒素及血紅蛋白含量極低，適合于大多數(shù)細胞的培養(yǎng)。

2、胚胎干細胞及間充質(zhì)干細胞專用胎牛血清

BioInd對不同批號的血清（10%胎牛血清）進行細胞培養(yǎng)來篩選，在既定條件下測定未分化細胞克隆數(shù)（ES-D3鼠多能性細胞，ATCC，CRL-1934），篩選出保持干細胞未分化狀態(tài)良好的胚胎干培養(yǎng)專用胎牛血清血清，能很好的支持胚胎干細胞的體外培養(yǎng)及研究。

間充質(zhì)干細胞專用胎牛血清經(jīng)篩選適合間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)。

3、熱滅活胎牛血清

血清熱滅活通過提高血清溫度到56度并且保持該溫度30分鐘完成。熱滅活可以破壞補體，用于細胞表面抗原抗體研究。對于大多數(shù)細胞而言，熱滅活并非必須，多個實驗表明，熱滅活對于提高細胞培養(yǎng)效果并無改善，而且熱滅活會使血清沉淀增加，除非必須，否則不建議做血清熱滅活。

4、活性炭過濾胎牛血清（炭吸附胎牛血清）

脫碳胎牛血清用于體外培養(yǎng)驗證激素的作用效果。研究包括類固醇受體連接，細胞受體類固醇調(diào)節(jié)，各種組織激素分泌和甲狀腺激素功能。生產(chǎn)程序為使用活性碳和右旋糖苷去除胎牛血清中的激素。