細(xì)胞系基因敲低技術(shù)指導(dǎo)

簡(jiǎn)介（INTRODUCTION）
目前實(shí)驗(yàn)室常用的基因敲低技術(shù)有三種，分別是shRNA，siRNA和CRISPR/Cas 系統(tǒng)；shRNA和siRNA都是在RNA水平上降低蛋白的表達(dá)，CRISPR/Cas是在DNA水平上降低蛋白的表達(dá)；shRNA與siRNA的加工方式相同，在細(xì)胞核表達(dá)后被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中它們與Dicer結(jié)合去除環(huán)狀序列。在與RISC結(jié)合并去掉其中一條RNA鏈后，它們識(shí)別mRNA占有互補(bǔ)序列，導(dǎo)致mRNA降解。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，它可以將入侵的噬菌體和外源質(zhì)粒DNA片段整合到規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列crisper中，隨后被內(nèi)切酶切割形成crRNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成PAM互補(bǔ)區(qū)，指導(dǎo)cas9內(nèi)切酶來(lái)對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，從而達(dá)到在DNA水平上降低蛋白表達(dá)的目的。
材料（MATERIALS）
o  試劑（REAGENTS）
慢病毒包裝質(zhì)粒、LB、氨芐青霉素、Amp板子、小抽試劑盒、完全培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基（Opti‐MEM）、lipo2000、嘌呤霉素、細(xì)胞培養(yǎng)皿（10cm）、24孔板、12孔板、6 孔板、9孔板、0.45um濾膜  
o  試劑準(zhǔn)備（REAGENT SETUP）
    LB:已經(jīng)滅菌的新鮮LB(無(wú)抗)；
氨芐青霉素（1000X）：用ddH2O配制成終濃度為100mg/mL，用0.22um濾膜過(guò)濾后  分裝；嘌呤霉素：根據(jù)需要的濃度自行配制。
o  器械（EQUIPMENT）
    EP管、凍存管、離心機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、-80℃冰箱
實(shí)驗(yàn)步驟（PROCEDURE）
shRNA敲低細(xì)胞系?預(yù)期時(shí)間消耗：兩個(gè)星期間斷性實(shí)驗(yàn)
1．細(xì)胞嘌呤霉素濃度確定實(shí)驗(yàn)：
a．24孔板內(nèi)以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板，鋪?zhàn)銐蛄康目滓赃M(jìn)行后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞孵育過(guò)夜；
b．準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基-含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15μg/mL，至少5個(gè)梯度）；
c．細(xì)胞孵育過(guò)夜后加入篩選培養(yǎng)基，孵育細(xì)胞；
d．約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基；
e．每日監(jiān)測(cè)細(xì)胞觀察存活細(xì)胞比例。嘌呤霉素的最佳作用時(shí)間一般在1-4天之間；
f． 最小的抗生素使用濃度就是指從抗生素篩選開(kāi)始1-4天內(nèi)殺死所用細(xì)胞的最低篩選濃度。
2. shRNA庫(kù)中查找有沒(méi)有所需基因的shRNA,一般會(huì)有4-5條
3．拿到shRNA后加入LB搖菌小抽后繼續(xù)轉(zhuǎn)化后中抽，得到濃度較高的質(zhì)粒；
4．第一天晚上接種 293T 于6孔板，每孔接種70-80%（1×106個(gè)），并加入2ml培養(yǎng)基，每種 shRNA對(duì)應(yīng)一孔；
5．第二天早上轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：2ug shRNA, vsv-g 1ug， gag 2ug， Rev 2ug，lip2000 18ul；
6．第三天早上棄上清，加入1ml完全培養(yǎng)基；
7．第四天吸出含病毒的培養(yǎng)基上清液，4000rpm/min 離心 5min，吸上清用0.45um濾膜過(guò)濾后放入無(wú)菌的EP管中，-80℃保存(可保存六個(gè)月)，也可馬上使用；
8．第三天的時(shí)候可同時(shí)將目的細(xì)胞接12孔板，密度大約為5X105/ml；
9．第四天將12孔板中培養(yǎng)基上清去除，加入病毒上清1ml，感染6h后補(bǔ)加1ml新鮮培養(yǎng)基；
10．第五天更換篩選培養(yǎng)基，第七天換液（利用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選）等細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后將細(xì)胞移至6孔板，繼續(xù)加入嘌呤霉素維持，此為瞬敲細(xì)胞系。
11．穩(wěn)敲細(xì)胞系（篩選時(shí)嘌呤霉素濃度不變）是將瞬敲得到的細(xì)胞稀釋成10 cells/ml,轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng)，每孔100ul(大約每孔1個(gè)細(xì)胞）；
12．18-24h后，觀察每孔的細(xì)胞數(shù)，將只有一個(gè)細(xì)胞的孔做上標(biāo)記；
13．觀察做標(biāo)記的孔形成的克隆數(shù)，只形成1個(gè)克隆的被認(rèn)為是單克??；
14. 持續(xù)觀察確認(rèn)孔中克隆數(shù)，當(dāng)96孔板中的單克隆達(dá)到較高密度時(shí)，轉(zhuǎn)移至12孔板培養(yǎng)；
15．細(xì)胞在12孔板中達(dá)到較高密度時(shí)，轉(zhuǎn)移至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)取少量細(xì)胞鑒定效果（western blot 或QPCR）；
16．確認(rèn)表達(dá)后，將單克隆轉(zhuǎn)移至10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，一般需要2-4周細(xì)胞才能達(dá)到較高密度；
17．凍存細(xì)胞（凍存液不含抗生素）；
18．穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系建立以后，可降低抗生素濃度（如降成原來(lái)的一半）。
▲關(guān)鍵步驟：不同的細(xì)胞種類(lèi)對(duì)于接板時(shí)細(xì)胞數(shù)以及抗生素的濃度的選擇不同，需要自己摸索或者請(qǐng)教師兄師姐。
siRNA敲低細(xì)胞系 ?預(yù)期時(shí)間消耗：兩個(gè)星期間斷性實(shí)驗(yàn)
（以下步驟所有的量和濃度都是以孔為基礎(chǔ)）
1．轉(zhuǎn)染前一天，接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至細(xì)胞培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到 30~50％ (不同細(xì)胞生長(zhǎng)速度不一樣，因此，接種細(xì)胞的數(shù)量需要根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn))，請(qǐng)使用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基；
2．對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，按照如下操作準(zhǔn)備 lip2000‐siRNA 混合物：
a． 稀釋轉(zhuǎn)染試劑 lipo2000：使用前，將 lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑輕輕搖勻，然后取 2ul，用 100ul 不含血清的 Opti‐MEM 稀釋?zhuān)p輕混和，室溫孵育 5min； 
b．稀釋 siRNA：用 100ul Opti‐MEM 稀釋 40pmol 的 siRNA，輕輕混和；（對(duì)于 stock 濃度為 20uM 的 siRNA，加 2ul 即可）
c．稀釋好的 lipo2000 經(jīng)過(guò) 5min 的孵育后，與上述(b)稀釋好的siRNA 輕輕混和，室溫培養(yǎng)20min 以形成siRNA‐lipo2000混和物，溶液可能會(huì)有渾濁，不過(guò)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。 
3．將 siRNA‐lipo2000 混合液加入含有細(xì)胞以及培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕搖晃，使之混和；
4．將培養(yǎng)板置于 37 ℃的 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至檢測(cè)時(shí)間(24~96h)。沉默效率的檢測(cè)一般建議的時(shí)間為 24~72h。
▲關(guān)鍵步驟：轉(zhuǎn)染操作完成，經(jīng)過(guò) 37℃培養(yǎng) 4~6h后，可以將孔里含有 siRNA‐lipo2000 混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基，這樣也不會(huì)影響轉(zhuǎn)染的效率。注意：如果轉(zhuǎn)染時(shí)使用的是不含血清的培養(yǎng)基(即血清饑餓的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染)，4~6h 后必須換成完全培養(yǎng)基(含血清、含抗生素)，以確保細(xì)胞生長(zhǎng)。
CRISPR/Cas9敲低細(xì)胞系 ?預(yù)期時(shí)間消耗：兩個(gè)星期間斷性實(shí)驗(yàn)
1. 通過(guò)軟件設(shè)計(jì)基因的sgRNA并送到公司合成；
2. 拿到的sgRNA(上游，下游)需要復(fù)性，體系： sgRNA（F 100μM） 2μl，sgRNA（R 100μM）2μl ，NEB buffer2（sigma）2μl，ddH2O 14μl  95℃放置5min，然后自然冷卻至室溫；
3. cas9載體質(zhì)粒酶切，體系：cas9載體質(zhì)粒5μg，bsmb1內(nèi)切酶3μl，F(xiàn)astAP 3μl，buffer
6μL ，ddH2O補(bǔ)齊至60μl在37 ℃放置30min，然后0.8%核酸膠跑膠，可以看到兩條帶，分子量大的那條膠回收；
4. cas9質(zhì)粒酶切后回收產(chǎn)物和復(fù)性的sgRNA連接，使用T4連接酶，用量和步驟見(jiàn)T4連接酶說(shuō)明書(shū)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，挑點(diǎn)搖菌，鑒定后測(cè)序抽質(zhì)粒；
5. 得到的質(zhì)粒與shRNA敲低方式相同。
▲關(guān)鍵步驟：酶切需要徹底，并且需要設(shè)計(jì)出具有敲除效果的sgRNA。
針對(duì)性建議（TROUBLESHOOTING）
1.    細(xì)胞系敲低時(shí)細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)定會(huì)在感染時(shí)大面積死亡，所以無(wú)論是293T還是目的細(xì)胞狀態(tài)都需要非常良好；
2.    對(duì)于抗生素濃度以及病毒滴度最好能事先做一下預(yù)實(shí)驗(yàn)確定；
3.    重復(fù)檢測(cè)具有敲低效果的細(xì)胞系需要馬上凍存保種避免重新篩選，這一點(diǎn)很重要；
4.    慢病毒包裝得到的病毒最好現(xiàn)用，放于-80℃冰箱的病毒上清應(yīng)避免反復(fù)凍融。