腫瘤嚴(yán)重危害人類(lèi)健康,是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要原因之一。早期診斷并及時(shí)治療對(duì)于提高腫瘤治療效果和患者生存率至關(guān)重要。目前,組織活檢仍是腫瘤檢測(cè)的重要方式,但其仍存在諸多局限性,例如有創(chuàng)且易導(dǎo)致并發(fā)癥以及腫瘤組織存在異質(zhì)性等。液態(tài)活檢可通過(guò)檢測(cè)體液樣本中的核酸和蛋白質(zhì)等標(biāo)志物,從而反映腫瘤分子特征和動(dòng)態(tài)變化,因其具有無(wú)創(chuàng)便捷、可反復(fù)取樣和依從性高等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。然而,目前用于液態(tài)活檢的檢測(cè)方法普遍具有成本高、耗時(shí)長(zhǎng)和需要復(fù)雜設(shè)備等缺點(diǎn),這限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此,急需一種低成本、簡(jiǎn)單快速且高效準(zhǔn)確的腫瘤診斷新方法。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)系統(tǒng)是一種原核生物抵御外源核酸入侵的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng),其已被廣泛用于基因編輯和核酸檢測(cè)中。當(dāng)前CRISPR核酸檢測(cè)平臺(tái)中Cas9、Cas12、Cas13是最常用的效應(yīng)蛋白。與其他Cas蛋白不同,Cas12具有靶標(biāo)DNA激發(fā)的針對(duì)單鏈DNA的非特異性反式切割活性,基于其持續(xù)信號(hào)放大和單堿基分辨能力,已被用于高效且特異地檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物。筆者就CRISPR/Cas12系統(tǒng)在腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述,以期為CRISPR/Cas系統(tǒng)更好地應(yīng)用于腫瘤篩查和診斷提供參考及借鑒。

1 CRISPR/Cas12系統(tǒng)簡(jiǎn)介

CRISPR/Cas系統(tǒng)依據(jù)Cas蛋白組成及其發(fā)揮作用方式不同分為兩大類(lèi):第一類(lèi)主要特征為效應(yīng)復(fù)合物,由多個(gè)Cas蛋白組成;第二類(lèi)則只有1個(gè)大分子量、多結(jié)構(gòu)域的Cas效應(yīng)蛋白單體,包括Cas9、Cas12和Cas13,因其操作方便且簡(jiǎn)潔高效,因而更適用于基因編輯應(yīng)用。

與Cas9蛋白不同,Cas12(又稱(chēng)Cpf1)缺乏HNH結(jié)構(gòu)域,但可單獨(dú)利用其RuvC結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶標(biāo)DNA的切割(圖1)。Cas12a可在CRISPR RNA(crRNA)引導(dǎo)下識(shí)別位于靶標(biāo)核酸5′端富含胸腺嘧啶(T)的前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM),從而啟動(dòng)對(duì)靶標(biāo)DNA的切割(順式切割),同時(shí)它還可不加選擇地切割反應(yīng)體系中的非靶標(biāo)單鏈DNA(反式切割)。隨后,V型Cas蛋白的其他亞型也相繼被證實(shí)具有反式切割活性,如Cas12b、Cas12c、Cas12f(Cas14)等?；诖颂匦?已有多種基于CRISPR/Cas12的性能優(yōu)良的核酸檢測(cè)平臺(tái)被開(kāi)發(fā)出,并廣泛用于病原體、腫瘤和轉(zhuǎn)基因作物等領(lǐng)域。

圖1 CRISPR/Cas12a系統(tǒng)靶向識(shí)別切割和反式切割示意圖

2 CRISPR/Cas12系統(tǒng)在腫瘤核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)檢測(cè) 

ctDNA含有腫瘤相關(guān)遺傳信息,可代替腫瘤組織用于用藥指導(dǎo)、耐藥監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估等,是一種具有良好應(yīng)用前景的液態(tài)活檢標(biāo)志物。但ctDNA含量稀少,呈高度碎片化且半衰期極短,這對(duì)檢測(cè)方法帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。當(dāng)前ctDNA檢測(cè)方法操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴,不能有效滿(mǎn)足臨床需求。隨著CRISPR技術(shù)快速拓展,可利用Cas13和Cas12開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、成本便宜且靈敏特異的檢測(cè)平臺(tái)。雖然Cas13a更早被用于ctDNA樣本檢測(cè)。但當(dāng)檢測(cè)靶標(biāo)DNA時(shí),CRISPR/Cas13需增加DNA到RNA的體外轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié),這造成操作上的不便,因此CRISPR/Cas12更適用于ctDNA檢測(cè)。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變檢測(cè)對(duì)于肺癌患者用藥指導(dǎo)和療效監(jiān)測(cè)等具有重要作用。Feng等將CRISPR/Cas12a和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合開(kāi)發(fā)了一種新的EGFR 19del檢測(cè)方法,其檢測(cè)靈敏度可低至20 fmol/L,并可通過(guò)裸眼觀察判定反應(yīng)結(jié)果。Liu等構(gòu)建了基于CRISPR/Cas12a和Fe₃O₄磁性納米復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器,證實(shí)其對(duì)EGFR L858突變位點(diǎn)檢測(cè)具有高度的特異性、穩(wěn)定性和選擇性。該方法檢出限可低至3.3 amol/L,并成功用于臨床樣本檢測(cè)。筆者利用重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)引物引入PAM位點(diǎn)解決了Cas12a檢測(cè)靶標(biāo)序列無(wú)PAM位點(diǎn)問(wèn)題,并通過(guò)單雙堿基錯(cuò)配方式提高其檢測(cè)的特異性。并進(jìn)一步證實(shí)改良的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)具有極高的靈敏度和選擇性(0.02%),可在50 min內(nèi)精準(zhǔn)鑒定EGFR T790M和L858R突變。此外,BRCA1基因突變與女性乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系。Choi等將Cas12a反式切割活性和DNA功能化金納米顆粒結(jié)合開(kāi)發(fā)了一種無(wú)擴(kuò)增策略的生物傳感器,可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)BRCA1基因的比色檢測(cè),檢出限可低至0.34 fmol/L。

2.2 循環(huán)腫瘤微小RNA(miRNA)檢測(cè) 

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度只有20～23個(gè)核苷酸的小RNA,在腫瘤組織中異常表達(dá)。相對(duì)于組織樣本,體液中更易實(shí)現(xiàn)miRNA的識(shí)別與分離,可作為腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)的重要途徑。因此,開(kāi)發(fā)基于CRISPR的快速、廉價(jià)、敏感、特異的miRNA檢測(cè)方法對(duì)于腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早治療具有重要意義。

miR-17和miR-155在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),如乳腺癌和肺癌等。Jia等將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和CRISPR/Cas12a結(jié)合構(gòu)建成1個(gè)多功能的miRNA檢測(cè)平臺(tái),可用于miR-17和miR-155的檢測(cè),且其檢出限可低至0.29 fmol/L。miR-21在多種腫瘤中高表達(dá),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。Wang等利用滾環(huán)轉(zhuǎn)錄將miRNA轉(zhuǎn)變?yōu)?條帶上有多個(gè)pre-crRNA重復(fù)序列的長(zhǎng)單鏈RNA,其可被Cas12a主動(dòng)招募剪切并激活其反向切割活性,從而釋放熒光信號(hào)。該方法具有靈敏度高和通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),且可實(shí)現(xiàn)在真實(shí)樣本中用于miR-21檢測(cè)。miRNA let-7a是一種腫瘤抑制因子,其表達(dá)下調(diào)與某些腫瘤相關(guān),如卵巢癌、胃癌等。Wang等將莖環(huán)適配器與let-7末端結(jié)合后,利用反轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物被Cas12a識(shí)別切割后激活Cas12a的反式切割活性,非特異性地切割熒光報(bào)告DNA,從而釋放熒光信號(hào)。

2.3 DNA甲基化檢測(cè) 

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾,DNA甲基化異常被發(fā)現(xiàn)與腫瘤等疾病有關(guān)。因此,建立靈敏且可靠的甲基化檢測(cè)方法對(duì)于研究腫瘤發(fā)生機(jī)制并建立有效的診療策略具有重要意義。

膠原蛋白α2(I)啟動(dòng)子區(qū)DNA高度甲基化情況存在于多種腫瘤中。Li等將基于CRISPR/Cas12b開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)用于膠原蛋白α2(I)啟動(dòng)子區(qū)M3甲基化位點(diǎn)檢測(cè),證實(shí)其可對(duì)靶標(biāo)DNA甲基化程度進(jìn)行快速且準(zhǔn)確地定量。SEPT9基因甲基化(mSEPT9)可作為一種診斷宮頸癌的特異性生物學(xué)標(biāo)志物。Xu等將RPA和CRISPR/Cas12a聯(lián)用開(kāi)發(fā)出一種高靈敏和特異性檢測(cè)mSEPT9的新方法,其檢出限約為1 copy/μL,且可從高濃度背景基因組中檢出0.01%的mSEPT9。RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化可作為乳腺癌診斷和治療的生物學(xué)標(biāo)志物。Zhou等開(kāi)發(fā)了一種基于內(nèi)切酶輔助且無(wú)PAM依賴(lài)的RPA與CRISPR/Cas12a耦合的新型策略。受益于酶切的特異性、Lambda輔助的RPA高效擴(kuò)增及CRISPR/Cas系統(tǒng)的自我擴(kuò)增能力,該方法具有極優(yōu)的靈敏度和選擇性,可檢測(cè)低至0.05%的RASSF1A甲基化DNA。此外,該方法不僅可通過(guò)熒光法進(jìn)行檢測(cè),還可通過(guò)側(cè)流層析試紙條滿(mǎn)足即時(shí)檢測(cè)(point-of-care testing,POCT)需求。

2.4 病毒核酸檢測(cè) 

病毒感染與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因,及時(shí)準(zhǔn)確地進(jìn)行早期 HPV 診斷和分型對(duì)于宮頸癌的防控具有重要意義。HPV很難用傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及血清學(xué)技術(shù)檢測(cè),目前主要采用核酸檢測(cè)方法?；贑RISPR/Cas12獨(dú)特的反式切割能力,Chen等首次將CRISPR/Cas12a和RPA結(jié)合開(kāi)發(fā)出快速靈敏的DETECTR方法,可在1 h內(nèi)對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行準(zhǔn)確基因分型。Teng等證實(shí)CRISPR/Cas12b也可用于HPV16和HPV18的檢測(cè)與分型,且比CRISPR/Cas12a具有更高的檢測(cè)靈敏度。為滿(mǎn)足POCT需求,Tsou等構(gòu)建了金納米顆粒輔助的CRISPR/Cas12a檢測(cè)平臺(tái),可通過(guò)裸眼直接觀察HPV16和HPV18核酸檢測(cè)結(jié)果,不僅方便快捷,且成本低廉。

此外,乙肝病毒感染可導(dǎo)致肝癌,核酸檢測(cè)是鑒別其感染、判斷預(yù)后和監(jiān)測(cè)療效的重要手段。Ding等將CRISPR/Cas12a和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)聯(lián)用,開(kāi)發(fā)出用于乙肝病毒感染的快速檢測(cè)系統(tǒng),其可通過(guò)熒光法在13 min內(nèi)完成實(shí)時(shí)高敏檢測(cè),還可利用試紙條在20 min內(nèi)完成可視化檢測(cè),且檢測(cè)靈敏度可達(dá)1 copy/μL。同樣,因EB病毒能導(dǎo)致淋巴瘤及鼻咽癌,Yuan等將PCR和CRISPR/Cas12a聯(lián)用,所開(kāi)發(fā)的側(cè)流層析試紙條可方便、快速地完成EB病毒的POCT檢測(cè)。

3 CRISPR/Cas12系統(tǒng)在腫瘤蛋白標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 常規(guī)腫瘤蛋白標(biāo)志物檢測(cè) 

腫瘤蛋白標(biāo)志物主要是由腫瘤細(xì)胞分泌釋放到體液中的抗原、酶和激素等物質(zhì),其常在腫瘤患者中呈過(guò)量表達(dá)。因此,檢測(cè)其含量對(duì)于腫瘤的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷等具有重要意義。ELISA法是檢測(cè)腫瘤蛋白標(biāo)志物的最常用方法,但其存在檢測(cè)靈敏度低等問(wèn)題,因此需要開(kāi)發(fā)更為靈敏的檢測(cè)方法。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1是肝癌發(fā)生的重要細(xì)胞因子,可作為肝癌診斷的特異生物學(xué)標(biāo)志物之一。Dai等首次構(gòu)建了基于CRISPR/Cas12a的蛋白檢測(cè)平臺(tái),該平臺(tái)將核酸適配體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后,適配體作為Cas12a的識(shí)別底物啟動(dòng)其反式切割活性。該方法可成功用于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1檢測(cè),且具有良好的靈敏度和特異性。甲胎蛋白是診斷原發(fā)性肝癌重要的輔助指標(biāo)之一。Zhao等開(kāi)發(fā)了1個(gè)基于CRISPR/Cas12a的可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)分析物的檢測(cè)新平臺(tái)。該平臺(tái)可利用適配體/帶有PAM位點(diǎn)的雙鏈DNA/生物素標(biāo)記的單鏈DNA復(fù)合物用于臨床樣本中甲胎蛋白檢測(cè),其檢出限為0.07 fmol/L。此外,癌胚抗原對(duì)于多種腫瘤的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判定都具有重要臨床意義。Li等將具有多個(gè)識(shí)別區(qū)域的環(huán)狀DNA Walker和CRISPR/Cas12a結(jié)合,開(kāi)發(fā)出可用于多種靶標(biāo)物質(zhì)檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái),這進(jìn)一步拓展了CRISPR/Cas12的應(yīng)用場(chǎng)景。

3.2 外泌體中蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢測(cè) 

外泌體是表面呈凹半球狀的類(lèi)囊泡小體,可從血液、尿液及腦脊液等體液中分離得到,其內(nèi)部包含核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等多種物質(zhì),可反映母體細(xì)胞狀態(tài)。外泌體在腫瘤形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥中起關(guān)鍵作用,因此可作為腫瘤個(gè)體化診療的有效生物學(xué)標(biāo)志物。因外泌體在體液中含量極低,故需要使用高靈敏度檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

CRISPR技術(shù)的快速發(fā)展為外泌體檢測(cè)提供了新的思路和手段。Li等開(kāi)發(fā)了基于CRISPR/Cas12a的高靈敏鼻咽癌CD109⁺外泌體檢測(cè)平臺(tái)。該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)100 particles/mL,但其涉及ELISA和PCR等環(huán)節(jié),操作復(fù)雜且所需時(shí)間較長(zhǎng)。因此,直接使用適配體分離純化外泌體可簡(jiǎn)化相關(guān)操作。如Zhao等利用帶有阻斷器的適配體捕獲CD63⁺外泌體,兩者結(jié)合后適配體構(gòu)象發(fā)生改變而釋放阻斷器,上清中的游離阻斷器可激活Cas12a的反式切割活性,進(jìn)而釋放熒光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)外泌體的檢測(cè)。該法無(wú)需預(yù)擴(kuò)增,可有效簡(jiǎn)化操作,縮短反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)。此外,CRISPR/Cas12還可用于外泌體相關(guān)物質(zhì)檢測(cè),如蛋白質(zhì)等。Xing等使用抗體包被磁珠捕獲外泌體,與適配體結(jié)合后經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生可被Cas12a識(shí)別切割的長(zhǎng)重復(fù)片段,然后非特異性切割體系中的熒光探針釋放熒光信號(hào)。該平臺(tái)可成功用于臨床樣本中外泌體表面蛋白nucleolin和程序性死亡配體1的定量檢測(cè)。

4 總結(jié)與展望

作為新一代可拓展性檢測(cè)技術(shù),CRISPR/Cas系統(tǒng)開(kāi)創(chuàng)了核酸檢測(cè)新時(shí)代。本文對(duì)CRISPR/Cas12的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制進(jìn)行了簡(jiǎn)介,并對(duì)基于CRISPR/Cas12所開(kāi)發(fā)的多種腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行了詳細(xì)闡述。該系統(tǒng)表現(xiàn)出靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單和成本低廉等優(yōu)勢(shì),并可實(shí)現(xiàn)快速POCT的目的,這突破了傳統(tǒng)腫瘤檢測(cè)技術(shù)的局限性,在腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和前景。

但目前基于CRISPR/Cas12的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)仍面臨不少挑戰(zhàn):(1)大多數(shù)方法需與核酸擴(kuò)增技術(shù)(如RPA)相結(jié)合以提高檢測(cè)靈敏度。但該過(guò)程仍需分步進(jìn)行,這極大增加了檢測(cè)時(shí)間和工作量。雖已有研究開(kāi)發(fā)了無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)平臺(tái),但仍存在檢出限較低問(wèn)題。應(yīng)進(jìn)一步探索可整合等溫?cái)U(kuò)增及信號(hào)輸出的一體化設(shè)備以改進(jìn)其臨床應(yīng)用。(2)PAM序列限制。絕大多數(shù)Cas12識(shí)別靶標(biāo)序列高度依賴(lài)PAM序列,這限制了其檢測(cè)的通用性。除通過(guò)擴(kuò)增引物引入PAM序列外,今后還需尋找更多非嚴(yán)格依賴(lài)PAM位點(diǎn)的Cas蛋白,以增加其檢測(cè)的靈活性。(3)脫靶效應(yīng)。即由于crRNA與非靶標(biāo)序列結(jié)合而發(fā)生脫靶切割,從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。可通過(guò)crRNA的精心設(shè)計(jì)以提高靶向切割效應(yīng),從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。(4)高通量檢測(cè)。大多數(shù)基于CRISPR/Cas12的檢測(cè)平臺(tái)只能實(shí)現(xiàn)對(duì)單一腫瘤標(biāo)志物的定性檢測(cè)。因腫瘤與多種生物學(xué)標(biāo)志物濃度變化情況緊密相關(guān),故需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)可完成高通量快速檢測(cè)與定量檢測(cè)的通用平臺(tái)。綜上所述,通過(guò)對(duì)基于CRISPR/Cas12的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)的不斷優(yōu)化完善,特別是隨著材料學(xué)及交叉學(xué)科的迅速發(fā)展,CRISPR/Cas12系統(tǒng)在腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域?qū)?huì)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值,有望在腫瘤早期診斷、療效監(jiān)測(cè)、用藥指導(dǎo)和預(yù)后判斷等方面發(fā)揮重要作用。

相關(guān)產(chǎn)品;

RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列